Metodi di ricerca biologica molecolaresvolgere un ruolo importante nella medicina moderna, medicina legale e biologia. Grazie ai progressi nello studio del DNA e dell'RNA, una persona è in grado di studiare il genoma del corpo, determinare l'agente causale della malattia, riconoscere l'acido nucleico desiderato in una miscela di acidi, ecc.
Negli anni '70 e '80, gli scienziati furono i primi a riuscireper decifrare il genoma umano. Questo evento ha dato impulso allo sviluppo dell'ingegneria genetica e della biologia molecolare. Lo studio delle proprietà del DNA e dell'RNA ha portato al fatto che ora è possibile utilizzare questi acidi nucleici per diagnosticare la malattia, studiando i geni.
Metodi diagnostici biologici molecolaririchiedono materiale sorgente: più spesso si tratta di acidi nucleici. Esistono diversi modi per isolare queste sostanze dalle cellule degli organismi viventi. Ognuno di essi ha i suoi vantaggi e svantaggi e questo deve essere preso in considerazione quando si sceglie un metodo per isolare gli acidi nucleici in forma pura.
1. Ottenere DNA da Marmur.Il metodo consiste nel trattare una miscela di sostanze con alcol, a seguito del quale precipita il DNA puro. Lo svantaggio di questo metodo è l'uso di sostanze aggressive: fenolo e cloroformio.
2. Isolamento del DNA mediante Boom.La sostanza principale utilizzata qui è il tiocianato di guanidina (GuSCN). Favorisce la deposizione di acido desossiribonucleico su substrati specializzati, dai quali può essere successivamente raccolto mediante apposito tampone. Tuttavia, GuSCN è un inibitore del PTC e anche una piccola parte di esso, che entra nel DNA precipitato, può influenzare il corso della reazione a catena della polimerasi, che gioca un ruolo importante quando si lavora con gli acidi nucleici.
3. Deposizione di impurità.Il metodo differisce dai precedenti in quanto non sono le molecole di acido desossiribonucleico stesse ad essere precipitate, ma le impurità. Per fare ciò, vengono utilizzati scambiatori di ioni. Lo svantaggio è che non tutte le sostanze possono precipitare.
4. Screening di massa.Questo metodo viene utilizzato nei casi in cui non sono necessarie informazioni precise sulla composizione della molecola di DNA, ma è necessario ottenere alcuni dati statistici. Ciò è spiegato dal fatto che la struttura dell'acido nucleico può essere danneggiata se trattata con detergenti, in particolare alcali.
Tutti i metodi di ricerca biologica molecolare sono suddivisi in tre grandi gruppi:
1. Amplificazione (utilizzando una varietà di enzimi). Ciò include PCR - reazione a catena della polimerasi, che gioca un ruolo importante in molti dei metodi diagnostici.
2. Non amplificazione. Questo gruppo di metodi è direttamente correlato al funzionamento di miscele di acidi nucleici. Esempi sono 3 tipi di macchie, ibridazione in situ, ecc.
3. Metodi basati sul riconoscimento di un segnale da una molecola sonda che si lega a una specifica sonda di DNA o RNA. Un esempio è l'Hybride Capture System (hc2).
Molti metodi di diagnostica molecolare comportano l'uso di un'ampia gamma di enzimi. Di seguito sono riportati quelli più comunemente usati:
1. Restrictase - "taglia" la molecola di DNA nelle parti necessarie.
2. DNA polimerasi - sintetizza una molecola di acido desossiribonucleico a doppio filamento.
3. Trascrittasi inversa (trascrittasi inversa) - utilizzata per la sintesi del DNA sul modello di RNA.
4. DNA ligasi - responsabile della formazione di legami fosfodiestere tra nucleotidi.
5. Esonucleasi: rimuove i nucleotidi dalle estremità della molecola di acido desossiribonucleico.
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è attivautilizzato nella moderna biologia molecolare. Questo è un metodo in cui è possibile ottenere un numero enorme di copie da una molecola di DNA (per amplificare le molecole).
Le principali funzioni della PCR:
- diagnosi di malattie;
- clonazione di sezioni di DNA, geni.
Per eseguire la reazione a catena della polimerasiSono richiesti i seguenti elementi: la molecola di DNA originale, la DNA polimerasi termostabile (Taq o Pfu), i fosfati desossiribonucleotidi (fonti di basi azotate), i primer (2 primer per 1 molecola di DNA) e il sistema tampone stesso, in cui possono essere tutte le reazioni effettuata.
La PCR si compone di tre fasi: denaturazione, ricottura del primer e allungamento.
1. Denaturazione. A una temperatura di 94-95 gradi Celsius, si verifica la rottura dei legami idrogeno tra due filamenti di DNA e, di conseguenza, otteniamo due molecole a filamento singolo.
2. Ricottura dei primer. A una temperatura di 50-60 gradi Celsius, i primer sono attaccati alle estremità delle molecole di acido nucleico a filamento singolo in base al tipo di complementarità.
3. Allungamento. A una temperatura di 72 gradi, si verifica la sintesi delle molecole di acido desossiribonucleico a doppia elica figlie.
Metodi di ricerca biologica molecolarespesso richiedono la conoscenza della sequenza nucleotidica nella molecola di acido desossiribonucleico. Il sequenziamento viene eseguito per determinare il codice genetico. La diagnostica molecolare del futuro si baserà sulle conoscenze acquisite dal sequenziamento umano.
Si distinguono i seguenti tipi di sequenziamento:
