Molekyyliset biologiset tutkimusmenetelmätjoilla on suuri rooli nykyaikaisessa lääketieteessä, kriminalistisessa tutkimuksessa ja biologiassa. DNA- ja RNA-tutkimusten edistymisen ansiosta henkilö pystyy tutkimaan organismin genomia, tunnistamaan taudin aiheuttavan aineen, tunnistamaan halutun nukleiinihapon happojen seoksessa jne.
1970-luvulla ja 1980-luvulla tutkijat olivat ensimmäisiä menestyksekkäitäihmisgenomin tulkitsemiseksi. Tämä tapahtuma antoi sysäyksen geenitekniikan ja molekyylibiologian kehittymiselle. DNA: n ja RNA: n ominaisuuksien tutkiminen on johtanut siihen, että nyt voit käyttää näitä nukleiinihappoja taudin diagnosoimiseksi ja geenien tutkimiseksi.
Molekyyliset biologiset diagnostiset menetelmätedellyttävät lähtöaineen läsnäoloa: useammin se on nukleiinihappoja. On olemassa useita tapoja eristää nämä aineet elävien organismien soluista. Jokaisella niistä on sen edut ja haitat, ja tämä on otettava huomioon valittaessa menetelmää nukleiinihappojen eristämiseksi puhtaassa muodossaan.
1. DNA: n hankkiminen Marmurilta.Menetelmä käsittää aineen seoksen käsittelemisen alkoholilla, jonka seurauksena puhdas DNA saostuu. Tämän menetelmän haittapuolena on aggressiivisten aineiden käyttö: fenoli ja kloroformi.
2. DNA: n eristäminen Boomilla.Tässä käytetty perusaine on guanidiinitiosyanaatti (GuSCN). Se edistää deoksiribonukleiinihapon kertymistä erikoistuneille substraateille, josta se voidaan myöhemmin kerätä erikoispuskurilla. GuSCN on kuitenkin PTC: n inhibiittori ja jopa pieni osa siitä, joka on pudonnut saostettuun DNA: han, voi vaikuttaa polymeraasiketjureaktion kulkuun, jolla on tärkeä rooli nukleiinihappojen kanssa.
3. Epäpuhtauksien leviäminen.Menetelmä eroaa edellisistä, koska itse deoksiribonukleiinihapon molekyylit eivät saostuneet vaan epäpuhtaudet. Tämän saavuttamiseksi käytä ioninvaihtimia. Haittapuolena on, että kaikki aineet eivät voi sakkautua.
4. Massan seulonta.Tätä menetelmää käytetään tapauksissa, joissa et tarvitse tarkkoja tietoja DNA-molekyylin koostumuksesta, mutta tarvitset joitain tilastotietoja. Tämä johtuu siitä, että nukleiinihapon rakenne voi vaurioitua pesuaineiden, erityisesti alkalisten, käsittelyn aikana.
Kaikki molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät on jaettu kolmeen suureen ryhmään:
1. Amplification (käyttäen erilaisia entsyymejä). Tämä sisältää PCR - polymeraasiketjureaktion, jolla on suuri merkitys monissa diagnostisissa menetelmissä.
2. Nimettömyys. Tämä menetelmäryhmä liittyy suoraan nukleiinihappojen seosten toimintaan. Esimerkkejä ovat 3 blottingtyyppiä, in situ -hybridisaatio jne.
3. Menetelmät, jotka perustuvat signaalin tunnistamiseen koettimolekyylistä, joka sitoutuu spesifiseen DNA- tai RNA-koettimeen. Esimerkkinä on Hybride Capture System (hc2) hybridisaatiojärjestelmä.
Monet molekyylidudiagnostiikkaan liittyvät menetelmät edellyttävät laajan valikoiman entsyymejä. Yleisimmin käytetyt ovat seuraavat:
1. Restrictase - "leikkaa" DNA-molekyylin tarpeellisiin osiin.
2. DNA-polymeraasi - syntetisoi kaksijuosteisen deoksiribonukleiinihappomolekyylin.
3. Reverse transkriptaasi (revertase) - käytetään DNA: n syntetisoimiseen RNA-matriisissa.
4. DNA-ligaasi - on vastuussa fosfodiesterisidosten muodostumisesta nukleotidien välillä.
5. Eksonukleaasi - poistaa nukleotidit deoksiribonukleiinihappomolekyylin päistä.
Polymeraasiketjureaktio (PCR) on aktiivinenjota käytetään nykyaikaisessa molekyylibiologiassa. Tämä on menetelmä, jossa valtava määrä kopioita voidaan saada yhdestä DNA-molekyylistä (monistetaan molekyylejä).
PCR: n tärkeimmät toiminnot ovat:
- tautien diagnostiikka;
- DNA: n, geenien kloonaus.
Polymeraasiketjureaktion suorittaminenvaatii seuraavat osat: ensimmäinen DNA-molekyyli, lämpöstabiili DNA-polymeraasi (Taq- tai Pfu), deoksiribonukleotidi fosfaatit (typpi- emäksiä), alukkeita (aluke 2 1 DNA-molekyyli), ja puskuri itse järjestelmän, joka voi suorittaa kaikki reaktiot.
PCR koostuu kolmesta vaiheesta: denaturointi, alukkeiden annealing ja venymä.
1. Denaturointi. 94-95 asteen lämpötilassa vetysidosten hajoaminen DNA: n kahden säikeen välillä on, ja tuloksena saadaan kaksi yksisäikeistä molekyyliä.
2. Alukkeiden hehkutus. 50 - 60 ° C: n lämpötilassa alukkeet kiinnittyvät komplementaarisuuden tyypin yksijuosteisten nukleiinihappomolekyylien päihin.
3. Venymä. 72 asteen lämpötilassa esiintyy tälle dyoksiribonukleiinihapon tytär- kaksisäikeisten molekyylien synteesiä.
Molekyyliset biologiset tutkimusmenetelmätusein edellytetään tietämystä nukleotidien sekvenssistä deoksiribonukleiinihapon molekyylissä. Sekvensointi suoritetaan geneettisen koodin määrittämiseksi. Tulevaisuuden molekulaarinen diagnostiikka perustuu ihmisen järjestyksen määrittämiseen saatuun tietoon.
Seuraavat sekvensointityypit erotetaan toisistaan:
