Etudier et identifier les options de la structureL'ADN utilise la méthode génétique moléculaire. Pour chaque morceau d'ADN à l'étude, la région est un chromosome, un gène ou un allèle, les méthodes sont différentes. Au cœur de chaque méthode de génétique moléculaire contient certaines manipulations d'ARN et d'ADN. Toutes ces méthodes sont très complexes, ne peuvent être effectuées sans conditions de laboratoire et le personnel doit être hautement qualifié. Ce travail se déroule en plusieurs étapes.
Des échantillons d'ARN ou d'ADN doivent d'abord être obtenus.Ici, la méthode de génétique moléculaire peut être appliquée à presque tous les matériaux: une goutte de sang, des globules blancs, une culture de fibroblastes, une membrane muqueuse (grattage), même des follicules pileux - l'ADN peut être obtenu à partir de n'importe quel échantillon. Il convient à l'application de n'importe quelle méthode de génétique moléculaire et de ses différentes variantes, et l'ADN déjà isolé est stocké au gel pendant une longue période. La deuxième étape est consacrée à l'accumulation des fragments d'ADN nécessaires (amplification), mais la réaction en chaîne par polymérase in vitro (in vitro, sans la participation d'un organisme vivant) contribue à la garantir. En conséquence, le fragment d'ADN sélectionné est multiplié par cette réaction en chaîne et la quantité d'ADN augmente littéralement un million de fois.
La troisième étape des méthodes de génétique moléculairedes études suggèrent une restriction de l'ADN propagé (c'est la fragmentation, la déchirure ou la coupe). La restriction est effectuée en utilisant une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou d'agarose. Cette méthode de génétique moléculaire pour étudier l'ADN permet à chaque fragment d'occuper une position spécifique dans le gel. Après cela, le gel est traité avec du bromure d'éthidium, qui peut se lier à l'ADN, est irradié avec de la lumière ultraviolette, après quoi il est possible d'observer les zones d'éclat. Les méthodes de diagnostic génétique moléculaire sont diverses et nombreuses, cependant, les deux premières étapes sont caractéristiques de toutes. Mais afin d'identifier les fragments d'ADN, le gel peut être coloré avec de nombreuses autres méthodes existantes.
Aux moyens les plus directs et les plus courantsla détection des mycobactéries peut être attribuée à la méthode génétique moléculaire ci-dessus pour étudier l'ADN. Son essence est d'identifier des fragments spécifiques d'une chaîne d'agents pathogènes d'ADN dans le matériel de diagnostic. Les méthodes de diagnostic génétique moléculaire n'ont pas encore de moyen plus efficace de reconnaître une maladie telle que la tuberculose. En utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR), vous pouvez être sûr que l'ADN d'origine augmentera le nombre de copies un million de fois, c'est-à-dire qu'une amplification se produira, ce qui vous permettra de visualiser les résultats. Le niveau de sensibilité ici est très élevé - plus de quatre-vingt-quinze pour cent, ce qui est le principal avantage de cette méthode.
Autres méthodes de génétique moléculaireles études sur l'efficacité sont inférieures de moitié à la copie multiple, car dans ce cas, l'échantillon éditorial montre une séquence d'oligonucléotides spécifique qui a augmenté de cent six fois. Même le diagnostic culturel de la tuberculose respiratoire est beaucoup plus faible en sensibilité. C'est pourquoi la médecine moderne s'appuie sur des méthodes de génétique moléculaire pour le diagnostic de la tuberculose. Et la méthode décrite est particulièrement efficace lors de la rencontre avec des agents pathogènes à forte variabilité antigénique, ce qui est beaucoup plus difficile à déterminer d'une autre manière - elle nécessite des milieux nutritifs spéciaux et un long temps de culture. Les méthodes génétiques biochimiques et moléculaires donnent des effets complètement différents.
Le diagnostic de tuberculose par PCR est le plusen utilisant souvent ces séquences d'ADN qui sont spécifiques aux quatre types de la maladie. Pour atteindre cet objectif, on utilise le plus souvent des amorces qui identifient des séquences d'éléments IS (IS-986, IS-6110), car ces éléments migrateurs caractérisent purement des types de mycobacterium tuberculosis et sont toujours présents en plusieurs exemplaires dans le génome. L'ADN peut également être isolé de cultures pures et cliniques (patients expectorés) par toute autre méthode appropriée. Par exemple, il existe la méthode Boom, qui utilise un tampon de lyse à base de guanidine, de dioxyde de silicium et de thiocyanate comme support d'ADN. Le nombre de patients caractérisés par une excrétion bactérienne peu abondante augmente chaque année, et donc un niveau d'organisation complètement différent a été établi dans la pratique clinique: la méthode de génétique moléculaire pour étudier l'ADN joue déjà un rôle majeur dans le diagnostic.
Il faut cependant admettre qu'il n'est pas sansdésavantages. L'utilisation de la méthode PCR apporte souvent une énorme quantité de faux positifs, et le défaut n'est pas seulement des erreurs techniques, mais aussi les caractéristiques de la méthode elle-même. Entre autres choses, l'utilisation de cette méthode de diagnostic pour déterminer le degré de viabilité des mycobactéries identifiées est tout simplement impossible. Mais cet inconvénient n'est pas le plus important. Les méthodes génétiques moléculaires de diagnostic par PCR comportent un risque de contamination par l'ADN mycobactérien. Pour cette raison, les exigences de certification pour les laboratoires de PCR sont développées exclusivement rigoureuses, elles nécessitent trois salles isolées. La technologie PCR est moderne et très complexe, son utilisation nécessite un équipement approprié et un personnel hautement qualifié.
Résultats du diagnosticLes études PCR doivent nécessairement être comparées à d'autres données: un examen clinique, une radiographie, une microscopie de frottis, une culture et même la réponse à un traitement spécifique sont ici très importants. Dans cette série d'études, la PCR n'est qu'une composante. L'agent pathogène peut être détecté au tout début du diagnostic par les méthodes les plus simples et les plus rapides - bactériologiques.
Un microscope optique est utilisé ici (coloration parZiel-Nielsen) et luminescent (coloration fluorochrome). L'avantage de la bactérioscopie est la rapidité d'obtention des résultats. Une limitation de ses capacités en raison de sa faible sensibilité est considérée à juste titre comme un inconvénient. Cependant, c'est à cette méthode que la recommandation de l'OMS a été donnée comme la plus économique et la plus fondamentale pour la détection des patients tuberculeux. La détection des mycobactéries par la méthode bactériologique a une valeur prévisionnelle et l'excrétion bactérienne est quantifiée. Les méthodes génétiques moléculaires pour étudier la tuberculose y sont beaucoup plus confiantes.
La meilleure détection des mycobactéries est reconnueétudes culturelles. Le semis de matériel pathologique est effectué dans des environnements d'oeufs: Mordovian, Finn II, Levenshtein-Jensen et similaires. Un indicateur provisoire du développement de la résistance des mycobactéries aux médicaments et des preuves indirectes de l'efficacité est le nombre de mycobactéries ou de leurs colonies in vitro, si la méthode de recherche culturelle est utilisée. Pour augmenter le pourcentage d'excrétion des mycobactéries, le semis de matériel pathologique est effectué sur plusieurs supports.
Satisfaire les nombreuses culturesBesoins, y compris les agents pathogènes et fournir des milieux liquides. À cela, des systèmes de comptabilité de croissance automatisés de type VANTES sont également utilisés. Les cultures doivent être effectuées en incubation pendant une période allant jusqu'à sept à huit semaines. À ce moment, les semis avec un manque de croissance peuvent être considérés comme négatifs. Les tests biologiques sont considérés comme le moyen le plus efficace de détecter mycobacterium tuberculosis: ils infectent avec du matériel de diagnostic de cobayes, qui sont extrêmement sensibles à la tuberculose.
Un domaine de recherche intéressant quiouvert par le diagnostic par PCR, il est devenu l'étude de M. tuberculosis - infection latente. Le concept moderne d'infection tuberculeuse suggère que sur une centaine de personnes qui étaient en contact avec M. tuberculosis, quatre-vingt-dix pourraient bien être infectées, mais seulement dix d'entre elles ont une maladie active. Les autres ont une immunité antituberculeuse et, par conséquent, dans 90% des cas, l'infection restera latente. C'est la méthode de génétique moléculaire qui a permis de découvrir un tel schéma.
La génétique dit cinquante-cinq pour centles personnes dont les cultures de matériel pathologique étaient négatives et 80% des personnes infectées par M. tuberculosis, mais avec la maladie sans aucune manifestation radiographique, ont reçu des réponses PCR positives. C'est la méthode de diagnostic génétique qui a permis d'identifier les patients à risque à l'aide d'études par PCR, et les résultats de leurs analyses (microscopie et culture) étaient négatifs, et une infection subclinique de M. tuberculosis était présente.
Laboratoires bactériologiques du russeLes fédérations utilisent également la méthode accélérée des concentrations absolues: l'activité nitrate réductase des mycobactéries est testée au moyen du réactif Griss. Les centres antituberculeux utilisent une méthode qui peut déterminer la résistance aux médicaments. Ceci est semé en milieu liquide, où le système radiométrique et de fluorescence pour enregistrer la croissance des mycobactéries est automatisé. Une telle analyse se fait rapidement - jusqu'à deux semaines.
Actuellement, de nouvelles méthodes sont en cours de développement:la résistance aux mycobactéries des médicaments est évaluée au niveau du génotype. L'étude des mécanismes moléculaires de la résistance montre la présence de gènes dans les mycobactéries. Ces gènes sont associés à une résistance à certains médicaments. Par exemple, les gènes kasA, inhA et katG sont résistants à l'isoniazide, le gène rpoB est résistant à la rifampicine, les gènes ARN 16Sp et rpsL sont résistants à la streptomycine, emb1 à l'éthambutol, gyrA à la fluoroquinolone, etc.
Dans les diagnostics modernes a considérablement augmenténiveau génétique moléculaire de la méthode d'étude de l'ADN et a permis des études à grande échelle des mutations dans tout leur spectre. Nous savons maintenant que les mutations les plus courantes se trouvent dans les codons 516, 526 et 531 du gène rpoB, et une résistance à divers médicaments a également été identifiée. Il existe toute une gamme de méthodes pour taper les mycobactéries en utilisant non seulement des méthodes traditionnelles - biochimiques, biologiques et culturelles, mais des méthodes génétiques moléculaires modernes sont également largement utilisées. Il existe déjà des méthodes de diagnostic adéquates et adéquates pour la détection des maladies monogéniques. Ils sont basés sur des études d'ADN dans la région exacte d'un gène particulier. Ceci est, en règle générale, un processus complexe, long et coûteux, mais les données fournies par les méthodes d'analyse génétique moléculaire sont beaucoup plus précises et informatives que les données de toutes les autres analyses.
On sait depuis longtemps que l'ADN ne change pas partoutla vie du corps, qu'elle est la même dans n'importe quelle cellule nucléaire, et cela permet de prendre absolument toutes les cellules du corps pour analyse à tous les stades de l'ontogenèse. Le gène endommagé peut être détecté avant l'apparition des premiers symptômes, avant l'élargissement de la clinique de la maladie, ainsi que chez les hétérozygotes sains, mais avec une mutation du gène. Les méthodes de génétique moléculaire pour le diagnostic des maladies héréditaires permettent de l'identifier (par une approche diagnostique directe de l'ADN), mais aussi d'analyser la ségrégation de la maladie dans la famille avec des loci d'ADN marqueurs (sites polymorphes) qui sont étroitement liés au gène endommagé (c'est-à-dire une approche diagnostique indirecte de l'ADN). Direct ou indirect - tout diagnostic d'ADN est basé sur des méthodes qui identifient une zone strictement définie de l'ADN humain.
Les méthodes de diagnostic direct de l'ADN sont utilisées dansles cas où le coupable de la maladie héréditaire est connu, ainsi que les types de ses mutations sont connus. Par exemple, des méthodes directes sont recommandées pour un certain nombre de maladies. Ce sont la chorée de Huntington (extension des répétitions CTG), la phénylcétonurie (R408W), la fibrose kystique (delF508, mutation majeure) et similaires. Le principal avantage de la méthode directe est la précision absolue du diagnostic, et il n'est pas nécessaire de faire une analyse ADN du reste de la famille. Si une mutation est trouvée dans le gène correspondant, cela vous permet de confirmer de manière absolument précise le diagnostic d'hérédité, de déterminer le génotype pour le reste de la famille accablée.
Un autre avantage du diagnostic direct est considéréidentification du portage hétérozygote de mauvaises mutations chez les parents et les parents du défunt de la maladie. Cela est particulièrement vrai pour les maladies autosomiques récessives. Les méthodes directes présentent également des inconvénients. Pour les appliquer, vous devez connaître exactement l'emplacement du gène pathologique, sa structure exon-intron et le spectre de ses mutations. Toutes les maladies monogéniques n'ont pas reçu aujourd'hui des informations similaires. Le contenu informationnel des méthodes directes ne peut être considéré comme complet, car le même gène peut avoir un grand nombre de mutations pathologiques, ce qui détermine le développement de maladies héréditaires.
Des méthodes indirectes dans le diagnostic de l'ADN sont utiliséesdans des cas complètement différents: si le gène endommagé n'est pas identifié, mais seulement localisé sur le chromosome, ou si le diagnostic direct n'a pas donné de résultat (cela se produit si le gène a une organisation moléculaire complexe ou une longueur considérable, s'il a de nombreuses mutations pathologiques). Des méthodes indirectes sont utilisées pour analyser la ségrégation des marqueurs polymorphes dans la famille des allèles. Les marqueurs sont situés dans la même région chromosomique ou sont étroitement liés au locus de la maladie et représentent des suppressions ou insertions, des remplacements ponctuels, des répétitions et leur polymorphisme est dû à des quantités différentes dans le bloc d'éléments.
Le plus pratique pour le diagnostic indirectLes marqueurs polymorphes microsatellites et minisatellites qui sont répandus dans le génome humain sont considérés. Leur valeur s'exprime dans un contenu d'information élevé si la distance génétique entre les dommages du gène et le marqueur n'est pas trop grande. Dans ce dernier cas, la précision de l'évaluation est déterminée dans une large mesure par la fréquence de recombinaison entre le marqueur polymorphe et l'endommagement. Les méthodes de diagnostic indirect fournissent également une étape préliminaire obligatoire pour étudier la fréquence des allèles des populations analysées parmi les porteurs de mutations et les patients, ainsi que la nécessité de déterminer la probabilité de déséquilibre et de recombinaison de la liaison des marqueurs et des allèles des gènes mutants.
Segments courts d'ARN ou d'ADN, ainsi qu'un segment séparéun examen microscopique d'un gène ne peut pas être visualisé; par conséquent, des diagnostics génétiques moléculaires sont nécessaires pour identifier les mutations. Le «Projet du génome humain» existant, comme les autres avancées de la génétique moléculaire, a considérablement élargi la capacité de diagnostiquer les maladies héréditaires - tant pré- que postnatales. Ces méthodes peuvent fournir une détection précoce et prédire les maladies poly- et monogéniques dans lesquelles les débuts se produisent à l'âge adulte. Malheureusement, en termes de capacités techniques, les études de génétique moléculaire dépassent parfois le cadre éthique établi en matière d'hérédité, notamment lorsque le diagnostic est posé à l'adolescence et dans l'enfance.
Anomalies chromosomiques structurelles et quantitativessont les causes les plus courantes de cancer et de nombreuses malformations. Les aberrations chromosomiques doivent être identifiées, ce qui est important pour le conseil familial - pour évaluer le pronostic ainsi que le risque de reproduction dans les grossesses futures. L'analyse chromosomique est «l'étalon-or» du diagnostic génétique, mais elle a également des capacités limitées. Seules les méthodes d'analyse génétique moléculaire peuvent faire plus, car elles utilisent des marqueurs fluorescents basés sur des technologies de clonage qui peuvent détecter des changements chromosomiques subtils qui ne peuvent pas être détectés par des études cytogénétiques classiques avec leur haute sensibilité. Ces techniques élargissent de plus en plus nos capacités de diagnostic lors de l'examen des enfants présentant des troubles du développement, un retard mental et de nombreuses autres maladies héréditaires.
La connaissance était très importante pour l'humanitéla structure et les fonctions des gènes, les types de leur variabilité, la capacité à reconnaître les maladies héréditaires, qui se sont produites dans le cadre du développement de la génétique moléculaire. Ses méthodes visent à étudier la molécule d'ADN - à la fois lorsqu'elle est normale et lorsqu'elle est endommagée. L'acquisition de séquences nucléotidiques d'acide désoxyribonucléique (ADN) se déroule par étapes depuis l'obtention d'échantillons jusqu'à l'identification des fragments individuels. Isolement de l'ADN génomique des cellules, restriction (rupture), amplification (clonage), électrophorèse de fragments (séparation par charge électrique et poids moléculaire à l'aide d'un gel d'agarose). Identification de certains fragments localisés à sa surface par une bande discrète.
Ensuite, des filtres spéciaux entrent en jeu, avecau moyen de laquelle hybridation de chaque fragment avec des fragments d'ADN clones ou avec des sondes radioactives synthétiques, qui sont témoins, par lequel chaque fragment étudié sera égal. Si la position ou sa longueur a changé par rapport à la sonde, si un nouveau fragment est apparu ou a disparu, tout cela indique que le gène à l'étude a subi un réarrangement dans la séquence nucléotidique. Il existe huit méthodes principales de recherche en génétique moléculaire: séquençage (détermination de la séquence d'ADN), réaction en chaîne par polymérase (augmentation du nombre de séquences), obtention d'amorces de gènes connus, clonage d'ADN, obtention de molécules recombinantes, obtention de protéines à l'aide de molécules recombinantes, création d'un ensemble complet (collections, bibliothèques) des fragments clones obtenus par restriction.
