Biologiczne metody badań molekularnychodgrywają dużą rolę we współczesnej medycynie, medycynie sądowej i biologii. Dzięki postępom w badaniu DNA i RNA osoba jest w stanie zbadać genom organizmu, określić czynnik sprawczy choroby, rozpoznać pożądany kwas nukleinowy w mieszaninie kwasów itp.
W latach 70. 80. naukowcom po raz pierwszy udało sięodszyfrować ludzki genom. Wydarzenie to dało impuls do rozwoju inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Badanie właściwości DNA i RNA doprowadziło do tego, że te kwasy nukleinowe można teraz wykorzystać do diagnozowania choroby i badania genów.
Molekularne biologiczne metody diagnozywymagają materiału źródłowego: częściej są to kwasy nukleinowe. Istnieje kilka sposobów izolowania tych substancji od komórek żywych organizmów. Każdy z nich ma swoje zalety i wady, co należy wziąć pod uwagę przy wyborze metody izolacji kwasów nukleinowych w czystej postaci.
1. Uzyskanie DNA według Marmura.Metoda polega na przetwarzaniu mieszaniny substancji z alkoholem, w wyniku czego wytrąca się czyste DNA. Wadą tej metody jest stosowanie agresywnych substancji: fenolu i chloroformu.
2. Izolacja DNA przez Boom. Główną zastosowaną tutaj substancją jest tiocyjanian guanidyny (GuSCN). Promuje odkładanie kwasu dezoksyrybonukleinowego na specjalistycznych podłożach, z których można go następnie pobrać za pomocą specjalnego buforu. Jednak GuSCN jest inhibitorem PTC i nawet niewielka jego część, która dostaje się do wytrąconego DNA, może wpływać na przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy, która odgrywa ważną rolę podczas pracy z kwasami nukleinowymi.
3. Osadzanie się zanieczyszczeń. Metoda różni się od poprzednich tym, że to nie same cząsteczki kwasu dehoksyrybonukleinowego są wytrącane, ale zanieczyszczenia. Aby to osiągnąć, stosuje się wymieniacze jonowe. Wadą jest to, że nie wszystkie substancje mogą się wytrącać.
4. Masowe badania przesiewowe. Metodę tę stosuje się w przypadkach, gdy nie są potrzebne dokładne informacje o składzie cząsteczki DNA, ale trzeba uzyskać pewne dane statystyczne. Wyjaśnia to fakt, że struktura kwasu nukleinowego może zostać uszkodzona w wyniku działania detergentami, w szczególności alkaliami.
Wszystkie metody badań biologii molekularnej są podzielone na trzy duże grupy:
1. Amplifikacja (przy użyciu różnych enzymów). Obejmuje to PCR - reakcję łańcuchową polimerazy, która odgrywa dużą rolę w wielu metodach diagnostycznych.
2. Brak amplifikacji. Ta grupa metod jest bezpośrednio związana z działaniem mieszanin kwasów nukleinowych. Przykładami są 3 rodzaje blotów, hybrydyzacja in situ itp.
3. Metody oparte na rozpoznawaniu sygnału z cząsteczki sondy, która wiąże się z określoną sondą DNA lub RNA. Przykładem jest Hybride Capture System (hc2).
Wiele metod diagnostyki molekularnej obejmuje stosowanie szerokiej gamy enzymów. Poniżej znajdują się najczęściej używane:
1. Restrictase - „tnie” cząsteczkę DNA na niezbędne części.
2. Polimeraza DNA - syntetyzuje dwuniciową cząsteczkę kwasu dezoksyrybonukleinowego.
3. Odwrotna transkryptaza (odwrotna transkryptaza) – stosowana do syntezy DNA na matrycy RNA.
4. Ligaza DNA – odpowiedzialna za tworzenie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami.
5. Egzonukleaza – usuwa nukleotydy z końców cząsteczki kwasu dezoksyrybonukleinowego.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest aktywnastosowane we współczesnej biologii molekularnej. Jest to metoda, w której z jednej cząsteczki DNA można uzyskać ogromną liczbę kopii (wzmacniać cząsteczki).
Główne funkcje PCR:
- diagnostyka chorób;
- klonowanie skrawków DNA, genów.
Aby przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazyWymagane są następujące elementy: oryginalna cząsteczka DNA, termostabilna polimeraza DNA (Taq lub Pfu), fosforany deoksyrybonukleotydów (źródła zasad azotowych), startery (2 startery na 1 cząsteczkę DNA) oraz sam układ buforowy, w którym można przeprowadzone.
PCR składa się z trzech etapów: denaturacji, przyłączania starterów i elongacji.
1. Denaturacja. W temperaturze 94-95 stopni Celsjusza dochodzi do zerwania wiązań wodorowych między dwiema nićmi DNA, w wyniku czego otrzymujemy dwie cząsteczki jednoniciowe.
2. Wyżarzanie podkładów. W temperaturze 50-60 stopni Celsjusza startery są przyłączane do końców jednoniciowych cząsteczek kwasu nukleinowego zgodnie z rodzajem komplementarności.
3. Wydłużenie. W temperaturze 72 stopni zachodzi synteza potomnych dwuniciowych cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego.
Metody badań biologii molekularnejczęsto wymagają znajomości sekwencji nukleotydowej w cząsteczce kwasu dezoksyrybonukleinowego. Sekwencjonowanie przeprowadza się w celu określenia kodu genetycznego. Diagnostyka molekularna przyszłości będzie oparta na wiedzy uzyskanej z sekwencjonowania ludzi.
Wyróżnia się następujące rodzaje sekwencjonowania:
