Métodos de pesquisa biológica moleculardesempenhar um papel importante na medicina moderna, forense e biologia. Graças aos avanços no estudo do DNA e RNA, uma pessoa é capaz de estudar o genoma do corpo, determinar o agente causador da doença, reconhecer o ácido nucléico desejado em uma mistura de ácidos, etc.
Еще в 70-80-х годах ученым впервые удалось decifrar o genoma humano. Este evento impulsionou o desenvolvimento da engenharia genética e da biologia molecular. O estudo das propriedades do DNA e RNA levou ao fato de que agora você pode usar esses ácidos nucléicos para diagnosticar a doença, estudar os genes.
Métodos de diagnóstico biológico molecularrequerem material de origem: mais frequentemente, são ácidos nucléicos. Existem várias maneiras de isolar essas substâncias das células de organismos vivos. Cada um deles tem suas próprias vantagens e desvantagens, e isso deve ser levado em consideração ao escolher um método para isolar ácidos nucléicos na forma pura.
1. Obtendo DNA de Marmur. O método consiste em tratar uma mistura de substâncias com álcool, da qual precipita o DNA puro. A desvantagem desse método é o uso de substâncias agressivas: fenol e clorofórmio.
2. Isolamento de DNA de acordo com Boom. A principal substância utilizada aqui é o tiocianato de guanidina (GuSCN). Promove a deposição de ácido desoxirribonucléico em substratos especializados, a partir dos quais pode ser posteriormente coletado com um tampão especial. No entanto, o GuSCN é um inibidor de PTC, e mesmo uma pequena parte dele, que entra no DNA precipitado, pode afetar o curso da reação em cadeia da polimerase, que desempenha um papel importante no trabalho com ácidos nucléicos.
3. Deposição de impurezas. O método difere dos anteriores porque não são as próprias moléculas de ácido desoxirribonucléico que precipitam, mas sim as impurezas. Para conseguir isso, trocadores de íons são usados. A desvantagem é que nem todas as substâncias podem precipitar.
4. Triagem em massa. Este método é utilizado nos casos em que não são necessárias informações precisas sobre a composição da molécula de DNA, mas alguns dados estatísticos devem ser obtidos. Isso se explica pelo fato de que a estrutura do ácido nucléico pode ser danificada quando tratada com detergentes, em particular álcalis.
Todos os métodos de pesquisa biológica molecular são divididos em três grandes grupos:
1. Amplificação (usando uma variedade de enzimas). Isso inclui PCR - reação em cadeia da polimerase, que desempenha um grande papel em muitos dos métodos de diagnóstico.
2. Não amplificação. Este grupo de métodos está diretamente relacionado ao funcionamento das misturas de ácidos nucléicos. Os exemplos são 3 tipos de blots, hibridização in situ, etc.
3. Métodos baseados no reconhecimento de um sinal de uma molécula sonda, que se liga a uma sonda específica de DNA ou RNA. Um exemplo é o Hybride Capture System (hc2).
Muitos métodos de diagnóstico molecular envolvem o uso de uma ampla gama de enzimas. Abaixo estão os mais comumente usados:
1. Restrictase - “corta” a molécula de DNA nas partes necessárias.
2. DNA polimerase - sintetiza uma molécula de ácido desoxirribonucléico de fita dupla.
3. Transcriptase reversa (transcriptase reversa) - usada para a síntese de DNA no modelo de RNA.
4. DNA ligase - responsável pela formação de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos.
5. Exonuclease - remove os nucleotídeos das extremidades da molécula de ácido desoxirribonucléico.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) está ativausado na biologia molecular moderna. Este é um método no qual um grande número de cópias pode ser obtido de uma molécula de DNA (amplificar as moléculas).
As principais funções do PCR:
- diagnóstico de doenças;
- clonagem de seções de DNA, genes.
Para realizar a reação em cadeia da polimeraseOs seguintes elementos são necessários: a molécula de DNA original, DNA polimerase termoestável (Taq ou Pfu), fosfatos desoxirribonucleotídicos (fontes de bases nitrogenadas), primers (2 primers por 1 molécula de DNA) e o próprio sistema tampão, no qual todas as reações podem ser realizado.
A PCR consiste em três estágios: desnaturação, anelamento de primer e alongamento.
1. Desnaturação. A uma temperatura de 94-95 graus Celsius, ocorre a quebra das ligações de hidrogênio entre duas fitas de DNA e, como resultado, obtemos duas moléculas de fita simples.
2. Recozimento dos primers. A uma temperatura de 50-60 graus Celsius, os primers se fixam nas extremidades das moléculas de ácido nucleico de fita simples de acordo com o tipo de complementaridade.
3. Alongamento. A uma temperatura de 72 graus, ocorre a síntese de moléculas filhas de ácido desoxirribonucléico de fita dupla.
Métodos de pesquisa biológica molecularfrequentemente requerem conhecimento da sequência de nucleotídeos na molécula de ácido desoxirribonucleico. O sequenciamento é realizado para determinar o código genético. O diagnóstico molecular do futuro será baseado no conhecimento obtido com o sequenciamento humano.
Os seguintes tipos de sequenciamento são diferenciados:
