Для изучения и выявления вариантов в структуре A DNS a molekuláris genetikai módszert használja. Minden vizsgált DNS-darab esetében a régió kromoszóma, gén vagy allél, a módszerek különböznek. Az egyes molekuláris genetikai módszerek középpontjában bizonyos RNS és DNS manipulációk vannak. Ezek a módszerek nagyon bonyolultak, laboratóriumi körülmények nélkül nem hajthatók végre, a személyzetnek magasan képzettnek kell lennie. Ezt a munkát több szakaszban hajtják végre.
Először RNS- vagy DNS-mintákat kell beszerezni.Itt a molekuláris genetikai módszer szinte bármilyen anyagra alkalmazható: csepp vért, fehérvérsejteket, fibroblast tenyészetet, nyálkahártyát (kaparást), akár szőrtüszőket is - a DNS bármely mintából megkapható. Alkalmas bármilyen molekuláris genetikai módszer és azok különféle variánsai alkalmazására, és a már izolált DNS-t hosszú ideig fagyasztva tárolják. A második szakasz a szükséges DNS-fragmensek felhalmozódására (amplifikációra) irányul, ám az in vitro polimeráz láncreakció (in vitro, élő szervezet részvétele nélkül) segíti annak biztosítását. Ennek eredményeként a kiválasztott DNS-fragmenst ezen láncreakcióval szaporítják, és a DNS mennyisége szó szerint milliószor növekszik.
A molekuláris genetikai módszerek harmadik szakaszaA tanulmányok a szaporított DNS korlátozását sugallják (ez fragmentáció, szakadás vagy vágás). A restrikciót poliakrilamid vagy agaróz gél elektroforézissel hajtjuk végre. Ez a DNS tanulmányozására szolgáló molekuláris genetikai módszer lehetővé teszi, hogy az egyes fragmensek a gélben meghatározott helyet foglaljanak el. Ezután a gélt etidium-bromiddal kezeljük, amely kötődik a DNS-hez, és ultraibolya fénnyel besugározzuk, ezután meg lehet figyelni a ragyogási területeket. A molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek változatosak és sokféleségek, azonban az első két szakasz mindenkire jellemző. A DNS-fragmensek azonosítása érdekében a gélt számos más létező módszerrel megfesthetjük.
К самым прямым и распространённым способам A mikobaktériumok kimutatása a fenti molekuláris genetikai módszernek tulajdonítható a DNS vizsgálatához. Ennek lényege, hogy azonosítsa a DNS-kórokozók láncának a fragmentumait a diagnosztikai anyagban. A molekuláris genetikai diagnosztikai módszereknek még nincs hatékonyabb módja a betegségek, például a tuberkulózis felismerésére. A polimeráz láncreakció (PCR) használatával biztos lehet benne, hogy az eredeti DNS egymilliószor növeli a másolatok számát, azaz amplifikáció történik, és ez lehetővé teszi az eredmények megjelenítését. Az érzékenység itt nagyon magas - több mint kilencvenöt százalék, ami ennek a módszernek a fő előnye.
Egyéb molekuláris genetikai módszereka hatékonysággal kapcsolatos tanulmányok rosszabbrendűek, mint a többszörös másolás szó szerint felét, mert ebben az esetben a szerkesztői minta egy specifikus oligonukleotid szekvenciát mutat, amely százszor megnőtt. Még a légúti tuberkulózis kulturális diagnosztizálása is sokkal alacsonyabb érzékenységű. Ezért támaszkodik a modern orvostudomány a tuberkulózis diagnosztizálására a molekuláris genetikai módszerekre. A leírt módszer különösen akkor hatékony, ha találkozunk nagy antigénváltozású kórokozókkal, amelyeket más módon sokkal nehezebb meghatározni - speciális tápanyagokat és hosszú tenyésztési időt igényel. A biokémiai és molekuláris genetikai módszerek teljesen eltérő eredményeket adnak.
A tuberkulózis PCR-diagnosztizálása a legtöbbgyakran azokat a DNS-szekvenciákat használva, amelyek a betegség mind a négy típusára specifikusak. E cél elérése érdekében gyakran alkalmaznak primereket, amelyek azonosítják az IS elemek szekvenciáit (IS-986, IS-6110), mivel ezek a vándorló elemek tisztán a mycobacterium tuberculosis típusát jellemzik, és a genomban mindig több példányban vannak jelen. A DNS izolálható tiszta tenyészetekből és klinikailag (köpet-páciensek) bármely más alkalmas módszerrel. Például létezik a Boom-módszer, amely DNS-hordozóként guanidin, szilícium-dioxid és tiocianát alapú lizáló puffert használ. A csekély baktériumkiválasztással jellemezhető betegek száma évente növekszik, ezért a klinikai gyakorlatban egy teljesen más szintű szervezeti szint alakult ki: a DNS tanulmányozására szolgáló molekuláris genetikai módszer már nagy szerepet játszik a diagnózisban.
Mindazonáltal be kell vallanunk, hogy ő nem hiányzikhiányosságokat. A PCR módszer használata hatalmas mennyiségű hamis pozitív eredményt hoz, és a hiba nemcsak technikai hibák, hanem maga a módszer tulajdonságai is. Többek között ezt a diagnosztikai módszert egyszerűen lehetetlen felhasználni az azonosított mycobacteriumok életképességének meghatározására. De ez a hátrány nem a legfontosabb. A PCR-diagnosztika molekuláris genetikai módszerei a mikobakteriális DNS-fertőzés kockázatát hordozzák. Ezért a PCR laboratóriumok tanúsítási követelményei kizárólag szigorúak, három elkülönített helyiséget igényelnek. A PCR technológia korszerű és nagyon bonyolult, használatához megfelelő felszerelést és magasan képzett személyzetet igényel.
A diagnózis eredményeA PCR-vizsgálatokat szükségszerűen össze kell hasonlítani más adatokkal: itt nagyon fontos a klinikai vizsgálat, a radiográfia, a kenetmikroszkópia, a tenyésztés és még az adott kezelésre adott válasz is. Ebben a sorozatban a PCR csak egy összetevő. A kórokozó a diagnózis kezdetén felfedezhető a legegyszerűbb és leggyorsabb módszerekkel - bakteriológiai módon.
Itt fénymikroszkópot használunk (Ziel-Nielsen) és lumineszcens (fluorkróm színezés). A bakterioszkópia előnye az eredmények megszerzésének sebessége. A képességeinek alacsony érzékenység miatt történő korlátozását joggal tekintik hátránynak. Ugyanakkor e módszer alapján adták a WHO ajánlását a leggazdaságosabbnak és alapvetőnek a tuberkulózisos betegek kimutatására. A mycobacteriumok bakteriológiai módszerrel történő kimutatása előrejelzett értéket képvisel, és a baktériumok kiválasztását mennyiségileg meghatározzuk. A tuberkulózis tanulmányozására szolgáló molekuláris genetikai módszerek sokkal magabiztosabbak ebben.
A mikobaktériumok legjobb felismerését elismerikkulturális tanulmányok. A kóros anyag vetését tojáskörnyezetben végezzük: Mordovian, Finn II, Levenshtein-Jensen és hasonlókban. A mikobaktériumok drogokkal szembeni rezisztenciájának ideiglenes indikátora és a hatékonyság közvetett bizonyítéka a mikobaktériumok száma vagy azok kolóniái in vitro, ha kulturális kutatási módszert alkalmaznak. A mikobaktériumok kiválasztódásának növelése érdekében a patológiás anyag vetését több táptalajon végezzük.
A sok kulturális kielégítéseIgények, beleértve a kórokozókat, és folyékony közeget biztosítanak. Ezen kívül a VANTES típusú automatizált növekedési számviteli rendszereket is használják. A növényeket inkubációban kell elvégezni legfeljebb hét-nyolc hétig. Ekkorra a vetés növekedés hiányával negatívnak tekinthető. A biológiai vizsgálatokat tekintik a leghatékonyabb módszernek a mycobacterium tuberculosis kimutatására: tengerimalacok diagnosztikai anyagával fertőzik meg őket, amelyek rendkívül érzékenyek a tuberkulózisra.
Érdekes kutatási területA PCR-diagnosztikával megnyitott M. tuberculosis - latens fertőzés tanulmányozása lett. A tuberkulózis fertőzés modern koncepciója azt sugallja, hogy a M. tuberculosis-szal érintkező száz ember közül kilencven lehet fertőzött, de csak tíznek van aktív betegsége. A többinek tuberkulózis elleni immunitása van, ezért az esetek kilencven százalékában a fertőzés látens marad. A molekuláris genetikai módszer segített felfedezni egy ilyen mintát.
A genetikusok szerint ötvenöt százalékazok a személyek, akiknek a patológiás anyag tenyészete negatív volt, és a M. tuberculosis-ban fertőzött személyek nyolcvan százaléka, de radiográfiás megnyilvánulások nélküli betegség esetén pozitív PCR-választ kapott. A genetikai diagnosztikai módszer segítette a veszélyeztetett betegek azonosítását a PCR-vizsgálatokkal, elemzéseik eredményei (mikroszkópia és tenyésztés) negatívak voltak, és a M. tuberculosis szubklinikai fertőzése volt jelen.
Az orosz bakteriológiai laboratóriumokAz egyesületek az abszolút koncentráció gyorsított módszerét is alkalmazzák: a mikobaktériumok nitrát-reduktáz aktivitását a Griss-reagens segítségével teszteljük. A tuberkulózisközpontok olyan módszert használnak, amely meghatározza a gyógyszer-rezisztenciát. Ez vetés folyékony közegekben, ahol a mikobaktériumok növekedésének számbavételére szolgáló radiometrikus és fluoreszcens rendszer automatizált. Egy ilyen elemzést gyorsan - akár két hétig - elkészítenek.
Jelenleg új módszereket dolgoznak ki:A mikobaktériumok gyógyszerrezisztenciáját genotípus szinten kell értékelni. A rezisztencia molekuláris mechanizmusainak tanulmányozása megmutatja a gének jelenlétét a mikobaktériumokban. Ezeket a géneket bizonyos gyógyszerekkel szembeni rezisztencia jellemzi. Például a kasA, inhA és katG gének rezisztensek az izoniazidra, az rpoB gén rezisztens a rifampicinre, a 16Sp RNS és az rpsL gének rezisztensek a streptomicinre, az emb1 az ethambutolra, a gyrA a fluorokinolonra stb.
A modern diagnosztika jelentősen megnőtta DNS vizsgálati módszer molekuláris genetikai szintje, és lehetővé tette a mutációk teljes spektrumának széles körű vizsgálatát. Most már tudjuk, hogy a leggyakoribb mutációk az rpoB gén 516, 526 és 531 kodonjában találhatók, és a különféle gyógyszerekkel szembeni rezisztenciát is azonosították. Számos módszer létezik a mikobaktériumok tipizálására, nemcsak a hagyományos módszerekkel - biokémiai, biológiai és kulturális, hanem a modern molekuláris genetikai módszereket is széles körben alkalmazzák. Már léteznek megfelelő és megfelelő diagnosztikai módszerek a monogén betegségek kimutatására. Ezek egy adott gén pontos régiójában végzett DNS-vizsgálatokon alapulnak. Ez rendszerint összetett, időigényes és költséges folyamat, de a molekuláris genetikai elemzés módszerével szolgáltatott adatok sokkal pontosabbak és informatívabbak, mint az összes többi elemzés adatai.
Régóta ismert, hogy a DNS nem változik az egésza test élete, amely megegyezik bármely atommagban, és ez lehetővé teszi a test bármely sejtjének elemzését az ongenezis bármely szakaszában. A sérült gén az első tünetek megjelenése előtt, a betegség kibővített klinikája előtt, valamint egészséges heterozigóta embereknél, de a gén mutációjával kimutatható. Az örökletes betegségek diagnosztizálására szolgáló molekuláris genetikai módszerek lehetővé teszik annak azonosítását (közvetlen DNS-diagnosztikai megközelítéssel), valamint a betegség szegregációjának elemzését a marker DNS lókuszokkal (polimorf helyek), amelyek szorosan kapcsolódnak a sérült génhez (azaz közvetett DNS-diagnosztikai megközelítés). Közvetlen vagy közvetett - bármilyen DNS-diagnózis olyan módszereken alapul, amelyek az emberi DNS szigorúan meghatározott területét azonosítják.
A DNS - diagnosztika közvetlen módszereit alkalmazzákazok az esetek, amikor ismertek az örökletes betegségért felelős gén, valamint a mutációk típusai is. Például számos betegség esetén közvetlen módszerek ajánlottak. Ezek Huntington-féle korea (a CTG ismétlődések tágulása), fenilketonuria (R408W), cisztás fibrózis (delF508, fő mutáció) és hasonlók. A közvetlen módszer fő előnye a száz százalékos diagnosztikai pontosság, és nincs szükség a család többi részének DNS-elemzésére. Ha a megfelelő génben mutációt találunk, ez lehetővé teszi számunkra, hogy pontosan megerősítsük az öröklődés diagnózisát, és meghatározzuk a megterhelt család többi részének genotípusát.
A közvetlen diagnózis másik előnyét fontolóra veszika rossz mutációk heterozigóta hordozásának azonosítása a betegségben elhunytak rokonaiban és szüleiben. Ez különösen igaz az autoszomális recesszív betegségekre. A közvetlen módszereknek is vannak hátrányai. Alkalmazásukhoz pontosan ismernie kell a kóros gén lokalizációját, exon-intron szerkezetét és mutációinak tartományát. Nem minden monogén betegség kapott ma ilyen információt. A közvetlen módszerek informatív értéke nem tekinthető teljesnek, mivel ugyanazon génnek számos kóros mutációja lehet, ami meghatározza az örökletes betegségek kialakulását.
Indirekt módszereket alkalmaznak a DNS-diagnosztikábanteljesen más esetekben: ha a sérült gént nem azonosítják, hanem csak a kromoszómán lokalizálják, vagy ha a közvetlen diagnózis nem hozott eredményt (ez akkor történik, ha a gén komplex molekulaszervezetű vagy jelentős hosszúságú, ha sok kóros mutációk). Indirekt módszerekkel elemzik a polimorf markerek szétválasztását az allélcsaládban. A markerek ugyanabban a kromoszóma régióban helyezkednek el, vagy szorosan kapcsolódnak a betegség lokuszához, és ezek deléciók vagy inszerciók, pontszubsztitúciók, ismétlések, polimorfizmusuk pedig egy blokkban található eltérő számú elemnek köszönhető.
A legkényelmesebb a közvetett diagnosztikáhozmikroszatellit és minisatellit polimorf markereknek számítanak, amelyek elterjedtek az emberi genomban. Értéküket magas információtartalmuk fejezi ki, ha a génben lévő károsodás és a marker közötti genetikai távolság nem túl nagy. Ez utóbbi esetben a becslés pontosságát nagymértékben meghatározza a rekombináció gyakorisága a polimorf marker és a károsodás között. A közvetett diagnosztikai módszerek szintén előírják az elemzett populációk alléljainak gyakoriságának kötelező előzetes vizsgálatát a mutációk hordozói és a betegek között, valamint meg kell határozni az egyensúlyhiány és a gének markerek és mutáns allélek összekapcsolódásának valószínűségét.
RNS vagy DNS rövid szegmensei, valamint egyszereseka gént mikroszkópos vizsgálat során nem lehet megjeleníteni, ezért molekuláris genetikai diagnosztikai módszerekre van szükség a mutációk azonosításához. A meglévő "Emberi Genom Projekt", a molekuláris genetika egyéb eredményeihez hasonlóan, nagymértékben kibővítette az örökletes betegségek diagnosztizálásának lehetőségét, pre- és postnatalis állapotban egyaránt. Ezek a módszerek korai felismerést és előrejelzést nyújthatnak azoknak a poli- és monogén betegségeknek, amelyek felnőttkorban jelentkeznek. Sajnos a technikai képességek szempontjából a molekuláris genetikai kutatások néha meghaladják az öröklődéssel kapcsolatban kialakított etikai keretet, különösen akkor, ha a diagnosztikát serdülőkorban és gyermekkorban végzik.
Strukturális és kvantitatív kromoszóma-rendellenességekmind a rák, mind a sok rendellenesség leggyakoribb okai. Kromoszóma-rendellenességeket kell azonosítani, ami fontos a családi tanácsadáshoz - a jövőbeli terhességek prognózisának és reproduktív kockázatának felmérése érdekében. A kromoszómaelemzés a genetikai diagnózis "arany standardja", de képességei korlátozottak. Csak a molekuláris genetikai elemzési módszerek tehetnek többet, mert klónozási technológiákon alapuló fluoreszcens címkéket alkalmaznak, amelyek nagy érzékenységükkel képesek detektálni a finom kromoszóma-változásokat, amelyeket a klasszikus citogenetikai kutatások nem tudnak kimutatni. Ezek a technikák egyre inkább kiterjesztik diagnosztikai képességeinket, amikor fejlődési rendellenességekkel, mentális retardációval, sok más örökletes betegséggel küzdő gyermekeket vizsgálnak.
A tudás nagyon fontos volt az emberiség számáraa gének felépítése és funkciói, változékonyságuk típusai, az örökletes betegségek felismerésének képessége, ami a molekuláris genetika fejlődésével összefüggésben történt. Módszerei a DNS-molekula tanulmányozására irányulnak - mind normális állapotban, mind károsodás esetén. A dezoxiribonukleinsav (DNS) nukleotidszekvenciák megszerzése a minták megszerzésétől az egyes fragmensek azonosításáig szakaszokban halad. Genomikus DNS izolálása a sejtekből, restrikció (repedés), amplifikáció (klónozás), a fragmensek elektroforézise (szétválasztás elektromos töltéssel és molekulatömeggel agaróz gél alkalmazásával). A felületén található egyes töredékek diszkrét csíkkal történő azonosítása.
Ezután speciális szűrők kerülnek játékbaamelynek révén az egyes fragmensek klónozott DNS-fragmensekkel vagy szintetikus radioaktív próbákkal hibridizálódnak, amelyek kontrollak, és amelyek révén az egyes vizsgált fragmensek egyenlőek lesznek. Ha a helyzet vagy annak hossza megváltozott a próbához képest, ha új fragmens jelent meg vagy tűnt el, mindez azt jelzi, hogy a vizsgált gén átrendeződött a nukleotidszekvenciában. A molekuláris genetikai kutatásnak nyolc fő módszere van: szekvenálás (a DNS-szekvencia meghatározása), polimeráz láncreakció (a szekvenciák számának növelése), ismert gének primereinek előállítása, DNS klónozása, rekombináns molekulák előállítása, rekombináns molekulák felhasználásával fehérjék előállítása, teljes készlet (gyűjtemények, könyvtárak) klónozott fragmensek, amelyeket korlátozással nyertünk.
