構造内のオプションを調査および特定するにはDNAは分子遺伝学的方法によって適用されます。検査されるDNAの各部分について、領域は染色体、遺伝子、または対立遺伝子であり、方法は異なります。各分子遺伝学的手法の中心には、RNAとDNAによる特定の操作が含まれています。これらの方法はすべて非常に複雑であり、実験室の条件なしでは実行できず、担当者は高度な資格を持っている必要があります。この作業はいくつかの段階で実行されます。
まず、RNAまたはDNAサンプルを取得する必要があります。ここでは、分子遺伝学的手法をほぼすべての材料に適用できます。血液、白血球、線維芽細胞培養、粘膜（掻き取り）、さらには毛包など、あらゆるサンプルからDNAを取得できます。あらゆる分子遺伝学的手法やその変異体の適用に適しており、すでに単離されたDNAは凍結保存されます。第2段階は、必要なDNAフラグメントの蓄積（増幅）に専念し、in vitroポリメラーゼ連鎖反応（試験管内で、生物の関与なし）がそれを提供するのに役立ちます。その結果、選択されたDNAはこの連鎖反応を利用して増殖し、DNAの量は文字通り100万倍に増加します。
分子遺伝学的方法の第3段階研究には、複製されたDNAの制限が含まれます（これは断片化、引き裂き、または切断です）。制限は、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動を使用して実行されます。 DNAを研究するためのこの分子遺伝学的方法により、各フラグメントはゲル内で特定の位置を占めることができます。その後、ゲルをDNAに結合できる臭化エチジウムで処理し、紫外線を照射した後、発光領域を観察することができます。分子遺伝学的診断法は多様で多数ありますが、最初の2つの段階はすべてに典型的です。しかし、DNA断片を特定するために、ゲルは他の多くの既存の方法で染色することができます。
最も直接的で一般的な方法にマイコバクテリアの検出は、DNAを研究するための上記の分子遺伝学的方法に起因する可能性があります。その本質は、診断材料中のDNA鎖病原体の特定の断片を特定することです。分子遺伝学的診断法には、結核などの病気を認識するためのより効果的な方法がまだありません。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用すると、元のDNAによってコピー数が100万倍に増加すること、つまり増幅が発生することを確認できます。これにより、結果を視覚化できます。ここでは感度レベルが非常に高く、95％を超えています。これが、この方法の主な利点です。
他の分子遺伝学的方法この場合、編集プローブは特定のオリゴヌクレオチド配列が166倍に増加したことを示しているため、研究は文字通り複数のコピーの2倍の効果があります。呼吸器結核の文化的診断でさえ、その感度ははるかに低いです。現代医学が結核を診断するために分子遺伝学的方法に依存しているのはそのためです。そして、説明された方法は、別の方法で決定するのがはるかに難しい、抗原の変動性が高い病原体に遭遇したときに特に効果的です-特別な栄養培地と長い培養時間が必要です。生化学的および分子遺伝学的方法は、それらの効果において完全に異なる結果をもたらします。
結核のPCR診断を最も構築する多くの場合、この病気の4つのタイプすべてに固有のDNA配列を使用します。この目標を達成するために、IS要素（IS-986、IS-6110）の配列を明らかにするプライマーが最も頻繁に使用されます。これは、これらの移動要素が純粋に結核菌の種を特徴づけ、ゲノム内に常にいくつかのコピーで存在するためです。また、DNA抽出は、純粋な培養物および臨床（患者の喀痰）から、他の許容可能な方法で実行できます。たとえば、グアニジン、シリカ、チオシアン酸塩をベースにした溶解緩衝液をDNA担体として使用するブーム法があります。細菌の排泄が不十分な患者の数は年々増加しているため、臨床診療ではまったく異なるレベルの組織が確立されています。DNAを研究するための分子遺伝学的手法はすでに診断において主要な役割を果たしています。
しかし、私たちは彼がいないわけではないことを認めなければなりません不利な点。 PCR法を使用すると、多くの場合、偽陽性の結果が大量に発生します。これは、技術的なエラーだけでなく、方法自体の特性によるものです。とりわけ、この診断方法を使用して、同定されたマイコバクテリアの生存率を決定することは単に不可能です。しかし、この欠点は最も重要ではありません。 PCR診断の分子遺伝学的手法は、マイコバクテリアDNAの汚染のリスクを伴います。このため、PCRラボの認証要件は非常に厳しく開発されており、3つの隔離された部屋が必要です。 PCR技術は最新で非常に複雑であり、その使用には適切な機器と高度な訓練を受けた要員が必要です。
診断を行うとき、結果PCR研究は、必然的に残りのデータと比較する必要があります。ここでは、臨床検査、X線撮影、塗抹顕微鏡検査、培養、さらには特定の治療に対する反応さえも非常に重要です。この一連の研究では、PCRはコンポーネントの1つにすぎません。病原体は、診断の最初の段階で、最も簡単で最速の方法、つまり細菌学的な方法で検出できます。
ここでは光学顕微鏡を使用しています（Ziehl-Nielsen）および発光（蛍光色素による着色）。細菌鏡検査の利点は、結果を得る速度です。そして、その欠点は、感度が低いために機能が制限されていると正しく考えられています。しかし、結核患者を特定するための最も経済的で基本的な方法としてWHOが推奨しているのはこの方法です。細菌学的方法によるマイコバクテリアの検出には予測値があり、細菌の排泄が定量化されます。結核研究の分子遺伝学的方法は、これにはるかに自信を持って対処します。
マイコバクテリアの最良の検出が認められている文化研究。病理学的物質の播種は、モルドフスキー、フィンII、ローウェンシュタイン-ジェンセンなどの卵培地で行われます。薬剤に対するマイコバクテリアの耐性の発達の概算指標および有効性の間接的な証拠は、培養法が使用される場合、試験管内のマイコバクテリアまたはそれらのコロニーの数です。マイコバクテリアの排泄率を高めるために、病理学的物質の播種がいくつかの培地で行われます。
数多くの文化を満足させる必要に応じて、原因物質には液体媒体も付属しています。 VANTESなどの自動成長会計システムも使用されます。作物は最大7〜8週間培養する必要があります。この時点で、成長のない作物はネガティブと見なすことができます。生物学的サンプルは、結核菌を検出するための最も効果的な方法と考えられています。それらは、結核に非常に敏感な診断材料をモルモットに感染させます。
研究のエキサイティングな分野PCR診断により発見され、潜在性感染症である結核菌の研究が始まりました。結核菌感染症の現代の概念は、結核菌と接触した100人のうち、90人が感染する可能性があることを示唆していますが、活動性疾患を発症するのは10人だけです。残りは抗結核免疫を持っているので、90％の症例で感染は潜伏したままになります。このパターンを明らかにするのに役立ったのは分子遺伝学的方法でした。
遺伝学者は55パーセントが病理学的物質の培養が陰性である個人、および結核菌に感染しているが、X線写真の症状なしに進行している疾患を有する個人の80％は、陽性のPCR応答を受けた。 PCR研究を使用してリスクグループから患者を特定するのに役立ったのは遺伝子診断法であり、彼らの分析（顕微鏡検査および培養）の結果は陰性であり、無症候性結核菌感染が存在しました。
ロシアの細菌学研究所連盟はまた、絶対濃度の加速法を使用しています。マイコバクテリアの硝酸レダクターゼ活性は、Griss試薬を使用してテストされます。結核センターは、薬剤耐性を決定する方法を使用しています。これは、マイコバクテリアの増殖を記録するための放射分析および蛍光システムが自動化されている液体培地に播種しています。この分析は、最大2週間で迅速に実行されます。
現在、新しい方法が開発されています。マイコバクテリアの薬剤耐性は、遺伝子型レベルで評価されます。耐性の分子メカニズムの研究は、マイコバクテリアにも遺伝子が存在することを示しています。これらの遺伝子は、特定の薬剤に対する耐性に関連しています。たとえば、遺伝子kasA、inhA、katGはイソニアジドに耐性があり、rpoB遺伝子はリファンピシンに耐性があり、16Sp RNAおよびrpsL遺伝子はストレプトマイシンに耐性があり、emb1はエタンブトールに耐性があり、gyrAはフルオロキノロンに耐性があります。
最新の診断では、DNA研究法の分子遺伝学的レベルにより、スペクトル全体の突然変異の大規模な研究を実施することが可能になりました。現在、最も一般的な変異はrpoB遺伝子のコドン516、526、および531にあり、さまざまな薬剤に対する耐性が確認されていることがわかりました。生化学的、生物学的、文化的な方法だけでなく、現代の分子遺伝学的方法も広く使用されているため、マイコバクテリアをタイピングする方法は多岐にわたります。単一遺伝子疾患を検出する方法はすでに適切であり、正しい診断を提供します。それらは、特定の遺伝子の正確な領域でのDNA研究に基づいています。これは、原則として、複雑で時間と費用のかかるプロセスですが、分子遺伝学的分析の方法によって提供されるデータは、他のすべての分析のデータよりもはるかに正確で有益です。
DNAは全体にわたって変化しないことが長い間知られていました生物の寿命は、どの核細胞でも同じであり、これにより、個体発生のどの段階でも、生物のあらゆる細胞を完全に分析することができます。損傷した遺伝子は、最初の症状が現れる前、病気の発達した診療所の前、そして健康なヘテロ接合体の人々で検出できますが、遺伝子に変異があります。遺伝性疾患を診断するための分子遺伝学的手法により、遺伝性疾患を特定することができ（DNA診断の直接的なアプローチにより）、マーカーDNA遺伝子座（多型領域）と密接に関連している家族の疾患の分離を分析することができます。損傷した遺伝子（つまり、DNA診断の間接的なアプローチ）。直接的または間接的-すべてのDNA診断は、厳密に定義されたヒトDNAの領域を特定する方法に基づいています。
DNA診断の直接的な方法はで使用されます遺伝性疾患の原因となる遺伝子がわかっていて、その突然変異の種類もわかっている場合。たとえば、多くの病気には直接的な方法が推奨されます。これらは、ハンチントン舞踏病（CTGリピートの拡大）、フェニルケトン尿症（R408W）、嚢胞性線維症（delF508、主要な突然変異）などです。直接法の主な利点は、100％の診断精度であり、残りの家族のDNA分析を行う必要はありません。対応する遺伝子に変異が見つかった場合、これにより、遺伝の診断を非常に正確に確認し、残りの負担のある家族の遺伝子型を決定することができます。
直接診断のもう1つの利点が考慮されます病気で亡くなった人の親戚や両親における悪い突然変異のヘテロ接合性保因の同定。これは特に常染色体劣性疾患に当てはまります。直接法にも欠点があります。それらを適用するには、病理学的遺伝子の局在、そのエクソン-イントロン構造、およびその変異の範囲を正確に知る必要があります。今日、すべての単一遺伝子疾患がそのような情報を受け取っているわけではありません。同じ遺伝子が遺伝性疾患の発症を決定する多数の病理学的突然変異を有する可能性があるため、直接法の有益な価値は完全であるとは見なされません。
DNA診断の間接的な方法が使用されます完全に異なる場合：損傷した遺伝子が特定されていないが染色体にのみ局在している場合、または直接診断で結果が得られなかった場合（これは、遺伝子が複雑な分子組織または有意な長さを持っている場合、病理学的に多くある場合に発生します突然変異）。対立遺伝子ファミリーにおける多型マーカーの分離を分析するために、間接的な方法が使用されます。マーカーは同じ染色体領域にあるか、疾患の遺伝子座に密接に関連しており、欠失または挿入、点置換、反復であり、それらの多型はブロック内の要素の数が異なるためです。
間接診断に最も便利ヒトゲノムに広く分布しているマイクロサテライトおよびミニサテライト多型マーカーと見なされます。遺伝子の損傷とマーカーの間の遺伝距離が大きすぎない場合、それらの値はそれらの高い情報量で表されます。後者の場合、推定の精度は、多型マーカーと損傷の間の組換えの頻度によって大部分が決定されます。間接診断法はまた、突然変異の保因者と患者の間で分析された集団の対立遺伝子の頻度を研究する必須の予備段階に加えて、遺伝子のマーカーと突然変異対立遺伝子の連鎖の不均衡と組換えの確率を決定する必要性を提供します。
RNAまたはDNAの短いセグメントと単一顕微鏡検査では遺伝子を可視化できないため、変異を特定するには分子遺伝学的診断法が必要です。既存の「ヒトゲノムプロジェクト」は、分子遺伝学の他の成果と同様に、出生前と出生後の両方で遺伝性疾患を診断する可能性を大幅に拡大しました。これらの方法は、成人期に発症する多遺伝子性および単一遺伝子性疾患の早期発見と予後を提供することができます。残念ながら、技術的能力の観点から、分子遺伝学的研究は、特に青年期および小児期に診断が行われる場合、遺伝に関して確立された倫理的枠組みを超えることがあります。
構造的および定量的な染色体異常がんと多くの奇形の両方の最も一般的な原因です。染色体異常を特定する必要があります。これは家族カウンセリングにとって重要です。将来の妊娠における生殖リスクとともに予後を評価するためです。染色体分析は遺伝子診断の「ゴールドスタンダード」ですが、その能力は限られています。クローニング技術に基づく蛍光標識を使用し、古典的な細胞遺伝学的研究では検出できない微妙な染色体変化を高感度で検出できるため、分子遺伝学的分析法だけがそれ以上のことができます。これらの技術は、他の多くの遺伝性疾患を伴う発達障害、精神遅滞のある子供を検査する際の診断能力をますます拡大しています。
知識は人類にとって非常に重要でした遺伝子の構造と機能、それらの変動性のタイプ、分子遺伝学の発達に関連して起こった遺伝性疾患を認識する能力。その方法は、DNA分子を研究することを目的としています-それが正常であるときと損傷しているときの両方。デオキシリボ核酸（DNA）ヌクレオチド配列の取得は、サンプルの取得から個々のフラグメントの識別まで段階的に進行します。細胞からのゲノムDNAの単離、制限（破裂）、増幅（クローニング）、フラグメントの電気泳動（アガロースゲルを使用して電荷と分子量でフラグメントを分離）。個別のストリップによる表面にある特定のフラグメントの識別。
次に、特別なフィルターが機能します。それによって、クローン化されたＤＮＡフラグメントまたは対照である合成放射性プローブとの各フラグメントのハイブリダイゼーションが起こり、それによって、調査された各フラグメントが等しくなる。プローブと比較して位置またはその長さが変化した場合、新しいフラグメントが出現または消失した場合、これはすべて、研究対象の遺伝子がヌクレオチド配列の再配列を受けたことを示しています。分子遺伝学研究には、主に8つの方法があります。配列決定（DNA配列の決定）、ポリメラーゼ連鎖反応（配列数の増加）、既知の遺伝子のプライマーの取得、DNAのクローニング、組換え分子の取得、組換え分子を使用したタンパク質の取得、制限によって取得された完全なセット（コレクション、ライブラリ）のクローンフラグメント。
