Molekylære biologiske forskningsmetoderspille en viktig rolle i moderne medisin, rettsmedisin og biologi. Takket være fremskritt i studien av DNA og RNA, er en person i stand til å studere kroppens genom, bestemme årsakssårsagsmidlet, gjenkjenne ønsket nukleinsyre i en blanding av syrer, etc.
Tilbake på 1970- og 1980-tallet var forskere de første til å lykkeså dechiftere det menneskelige genomet. Denne hendelsen ga impuls til utviklingen av genteknologi og molekylærbiologi. Studien av egenskapene til DNA og RNA har ført til det faktum at nå kan du bruke disse nukleinsyrene for å diagnostisere sykdommen, studer generene.
Molekylære biologiske diagnostiske metoderkrever tilgjengeligheten av kildemateriale: oftere er det nukleinsyrer. Det finnes flere måter å isolere disse stoffene fra celler av levende organismer. Hver av dem har sine fordeler og ulemper, og dette må tas i betraktning når man velger en metode for å isolere nukleinsyrer i sin rene form.
1. Oppnå DNA fra Marmur.Metoden består i å behandle blandingen av stoffer med alkohol, noe som resulterer i at ren DNA feller ut. Ulempen med denne metoden er bruk av aggressive stoffer: fenol og kloroform.
2. Выделение ДНК по Буму.Hovedstoffet som brukes her er guanidintiocyanat (GuSCN). Det bidrar til avsetning av deoksyribonukleinsyre på spesialiserte substrater, hvorfra det senere kan samles ved hjelp av en spesiell buffer. Imidlertid er GuSCN en inhibitor av PTC, og selv en liten del av den, som har falt inn i det utfelte DNA, kan påvirke løpet av polymerasekjedereaksjonen, som spiller en viktig rolle når man arbeider med nukleinsyrer.
3. Осаждение примесей.Metoden er forskjellig fra de forrige, fordi det ikke er urenheter som deponeres, ikke dehoxyribonukleinsyremolekylene selv. For å gjøre dette, bruk jonbyttere. Ulempen er at ikke alle stoffer kan slå seg ned.
4. Massescreening.Denne metoden brukes i tilfeller der du ikke trenger nøyaktig informasjon om DNA-molekylets sammensetning, men det er nødvendig å oppnå noen statistiske data. Dette forklares ved at strukturen av en nukleinsyre kan bli skadet når den behandles med vaskemidler, spesielt med alkalier.
Alle molekylærbiologiske forskningsmetoder er delt inn i tre store grupper:
1. Amplifisering (ved hjelp av en rekke enzymer). Dette inkluderer PCR-polymerasekjedereaksjon, som spiller en stor rolle i mange av diagnostiske metoder.
2. Ikke-amplifisering. Denne gruppen av metoder er direkte relatert til driften av blandinger av nukleinsyrer. Eksempler er 3 typer blotting, in situ hybridisering, etc.
3. Metoder basert på anerkjennelse av et signal fra et probemolekyl som binder til en bestemt DNA- eller RNA-probe. Et eksempel er Hybrid Capture System (hc2) hybridiseringssystem.
Mange molekylære diagnostiske metoder involverer bruk av et omfattende utvalg av enzymer. Følgende er de mest brukte:
1. Restriksjonsenzym - "kutter" DNA-molekylet i nødvendige deler.
2. DNA-polymerase - syntetiserer et dobbeltstrenget deoksyribonukleinsyremolekyl.
3. Revers transkriptase (revertase) - brukes til å syntetisere DNA på en RNA-matrise.
4. DNA-ligase - er ansvarlig for dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom nukleotider.
5. Exonuclease - fjerner nukleotider fra endeseksjonene av et deoksyribonukleinsyremolekyl.
Polymerasekjedereaksjon (PCR) er aktivbrukt i moderne molekylærbiologi. Dette er en metode der et stort antall kopier kan fås fra ett DNA-molekyl (amplifiser molekyler).
Hovedfunksjonene til PCR:
- diagnose av sykdommer;
- kloning av DNA-seksjoner, gener.
For polymerasekjedereaksjonfølgende elementer er nødvendige: det originale DNA-molekylet, termostabil DNA-polymerase (Taq eller Pfu), deoksyribonukleotidfosfater (kilder til nitrogenbaser), primere (2 primere per 1 DNA-molekyl) og selve buffersystemet, der alle reaksjoner kan utføres.
PCR består av tre stadier: denaturering, annealing av primere og forlengelse.
1. Denaturering. Ved en temperatur på 94-95 grader bryter hydrogenbindingene mellom de to DNA-kjedene, og som et resultat får vi to enkeltstrengede molekyler.
2. Utglødning av grunning. Ved en temperatur på 50-60 grader er festere festet i endene av enstrengede nukleinsyremolekyler i henhold til typen komplementaritet.
3. Forlengelse. Ved en temperatur på 72 grader forekommer syntesen av dobbeltstrengede datter-molekyler av deoksyribonukleinsyre.
Molekylære biologiske forskningsmetoderkrever ofte kunnskap om nukleotidsekvensen i deoksyribonukleinsyremolekylet. Sekvensering utføres for å bestemme den genetiske koden. Fremtidens molekylære diagnostikk vil være basert på kunnskapen som er oppnådd i å bestemme sekvensen til en person.
Følgende typer sekvensering skilles:
