Molekularbiologische Forschungsmethodenspielen eine große Rolle in der modernen Medizin, Kriminalistik und Biologie. Dank der Fortschritte auf dem Gebiet der DNA- und RNA-Studien ist eine Person in der Lage, das Genom des Organismus zu untersuchen, den Erreger der Krankheit zu identifizieren, die gewünschte Nukleinsäure in einer Mischung von Säuren usw. zu erkennen.
Schon in den 1970er und 1980er Jahren Wissenschaftlerentziffere das menschliche Genom. Diese Veranstaltung gab der Entwicklung von Gentechnik und Molekularbiologie Impulse. Die Untersuchung der Eigenschaften von DNA und RNA führte dazu, dass es nun möglich ist, diese Nukleinsäuren zu verwenden, um die Krankheit zu diagnostizieren, Gene zu untersuchen.
Molekularbiologische Methoden der Diagnoseerfordern die Anwesenheit von Ausgangsmaterial: häufiger sind es Nukleinsäuren. Es gibt mehrere Möglichkeiten, diese Substanzen aus den Zellen lebender Organismen zu isolieren. Jede von ihnen hat ihre Vor- und Nachteile, und dies muss bei der Wahl der Methode der Isolierung von Nukleinsäuren in reiner Form berücksichtigt werden.
1. Präparation von DNA nach Marmur.Die Methode besteht darin, das Stoffgemisch mit Alkohol zu behandeln, wodurch reine DNA ausfällt. Der Nachteil dieser Methode ist die Verwendung von aggressiven Substanzen: Phenol und Chloroform.
2. DNA-Isolierung durch Boom.Die wichtigste Substanz, die hier verwendet wird - ist Guanidinthiocyanat (GuSCN). Es fördert die Ablagerung von Desoxyribonukleinsäure auf spezialisierte Substrate, aus dem es anschließend durch einen speziellen Puffer gesammelt werden. GuSCN jedoch - ist ein Inhibitor des TCP, und sogar ein kleiner Teil des in den DNA abgeschieden wird, den Verlauf der Polymerase-Kettenreaktion beeinflussen, was wichtig ist, wenn sie mit Nucleinsäuren arbeiten.
3. Ausfällung von Verunreinigungen.Die Methode unterscheidet sich von den vorherigen darin, dass nicht die Moleküle der Desoxyribonukleinsäure selbst ausgefällt werden, sondern Verunreinigungen. Verwenden Sie dazu Ionenaustauscher. Der Nachteil ist, dass nicht alle Substanzen ausfallen können.
4. Massenscreening.Diese Methode wird in den Fällen verwendet, in denen keine genauen Informationen über die Zusammensetzung des DNA-Moleküls benötigt werden, aber es ist notwendig, einige statistische Daten zu erhalten. Dies liegt daran, dass die Struktur der Nukleinsäure durch Behandlung mit Detergenzien, insbesondere mit Alkalien, geschädigt werden kann.
Alle molekularbiologischen Forschungsmethoden sind in drei große Gruppen unterteilt:
1. Amplifikation (unter Verwendung einer Vielzahl von Enzymen). Dazu gehört die PCR - Polymerase-Kettenreaktion, die bei vielen diagnostischen Methoden eine große Rolle spielt.
2. Nicht-Appellation. Diese Gruppe von Verfahren steht in direktem Zusammenhang mit dem Betrieb von Mischungen von Nukleinsäuren. Beispiele sind 3 Arten von Blotting, In-situ-Hybridisierung usw.
3. Verfahren basierend auf der Erkennung eines Signals von einem Sondenmolekül, das an eine spezifische DNA- oder RNA-Sonde bindet. Ein Beispiel ist ein Hybridisierungssystem in einer Hybrid-Capture-System-Lösung (HC2).
Viele Methoden der molekularen Diagnostik beinhalten die Verwendung einer breiten Palette von Enzymen. Unten sind die am häufigsten verwendeten:
1. Restrictase - "schneidet" das DNA-Molekül in die notwendigen Teile.
2. DNA-Polymerase - synthetisiert ein doppelsträngiges Molekül der Desoxyribonukleinsäure.
3. Reverse Transkriptase (Revertase) - verwendet, um DNA auf der RNA-Matrix zu synthetisieren.
4. DNA-Ligase - verantwortlich für die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden.
5. Exonuklease - entfernt Nukleotide aus den Endabschnitten des Moleküls der Desoxyribonukleinsäure.
Polymerasekettenreaktion (PCR) ist aktivwird in der modernen Molekularbiologie verwendet. Dies ist eine Methode, bei der eine große Anzahl von Kopien von einem einzelnen DNA-Molekül erhalten werden kann (Moleküle amplifizieren).
Die Hauptfunktionen von PCR sind:
- Diagnostik von Krankheiten;
Klonen von DNA und Genen.
Durchführung der Polymerase-Kettenreaktionbenötigt die folgenden Elemente: anfängliches DNA-Molekül, eine thermisch stabile DNA-Polymerase (Taq bzw. Pfu), Desoxyribonukleotid Phosphaten (Quellen von Stickstoff-Basen), der Primer (Primer 2 1-DNA-Molekül), und das Puffersystem selbst, das alle Reaktionen ausführen kann.
Die PCR besteht aus drei Stufen: Denaturierung, Annealing der Primer und Elongation.
1. Denaturierung. Bei einer Temperatur von 94-95 Grad Celsius setzt sich der Bruch der Wasserstoffbrücken zwischen den beiden DNA-Strängen fort, und als Ergebnis erhalten wir zwei einkettige Moleküle.
2. Annealing der Primer. Bei einer Temperatur von 50 bis 60 Grad Celsius werden Primer an den Enden einzelsträngiger Nucleinsäuremoleküle durch die Art der Komplementarität gebunden.
3. Dehnung. Bei einer Temperatur von 72 Grad erfolgt die Synthese von doppelsträngigen Tochtermolekülen der Desoxyribonukleinsäure.
Molekularbiologische Forschungsmethodenerfordern oft die Kenntnis der Nukleotidsequenz in einem Molekül der Desoxyribonukleinsäure. Die Sequenzierung wird verwendet, um den genetischen Code zu bestimmen. Die molekulare Diagnostik der Zukunft basiert auf Erkenntnissen, die bei der Bestimmung der Reihenfolge einer Person gewonnen wurden.
Folgende Arten der Sequenzierung werden unterschieden:
