Μοριακές βιολογικές μέθοδοι έρευναςπαίζουν μεγάλο ρόλο στη σύγχρονη ιατρική, την εγκληματολογία και τη βιολογία. Χάρη στην πρόοδο στη μελέτη του DNA και του RNA, το άτομο είναι σε θέση να διερευνήσει το γονιδίωμα του οργανισμού καθορίζουν την αιτιολογικός παράγοντας, να αναγνωρίζουν το επιθυμητό νουκλεϊκό οξύ σε ένα μίγμα οξέων, κλπ
Μέχρι τη δεκαετία του 1970 και του 1980, οι επιστήμονεςαποκρυπτογραφήσει το ανθρώπινο γονιδίωμα. Το γεγονός αυτό έδωσε ώθηση στην ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής και της μοριακής βιολογίας. Η μελέτη των ιδιοτήτων του DNA και του RNA οδήγησε στο γεγονός ότι τώρα είναι δυνατή η χρήση αυτών των νουκλεϊνικών οξέων για τη διάγνωση της νόσου, τη μελέτη των γονιδίων.
Μοριακές βιολογικές μεθόδους διάγνωσηςαπαιτούν την παρουσία υλικού έναρξης: πιο συχνά είναι τα νουκλεϊνικά οξέα. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι απομόνωσης αυτών των ουσιών από τα κύτταρα των ζώντων οργανισμών. Ο καθένας έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του και αυτό πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά την επιλογή της μεθόδου απομόνωσης των νουκλεϊνικών οξέων σε καθαρή μορφή.
1. Προετοιμασία του DNA σύμφωνα με το Marmur.Η μέθοδος συνίσταται στην κατεργασία του μίγματος των ουσιών αλκοόλης, καθιζάνει προκύπτον καθαρό DNA. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι η χρήση διαβρωτικών ουσιών, φαινόλη και χλωροφόρμιο.
2. Απομόνωση DNA από την Boom.Η βασική ουσία που χρησιμοποιείται εδώ είναι η θειοκυανική γουανιδίνη (GuSCN). Προωθεί την εναπόθεση δεοξυριβονουκλεϊνικού οξέος σε εξειδικευμένα υποστρώματα, από τα οποία στη συνέχεια μπορεί να συλλεχθεί με ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα. Ωστόσο, το GuSCN είναι ένας αναστολέας του PTC και ακόμη και ένα μικρό μέρος του, παγιδευμένο στο ίζημα του DNA, μπορεί να επηρεάσει την πορεία της αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη δουλειά με νουκλεϊνικά οξέα.
3. Καταβύθιση ακαθαρσιών.Η μέθοδος διαφέρει από τις προηγούμενες, διότι δεν κατακρημνίζονται τα μόρια του ίδιου του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος, αλλά οι ακαθαρσίες. Για να το κάνετε αυτό, χρησιμοποιήστε ιοντοανταλλάκτες. Το μειονέκτημα είναι ότι δεν μπορούν να καθιζάνουν όλες οι ουσίες.
4. Μαζική εξέταση.Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται σε εκείνες τις περιπτώσεις όπου δεν απαιτούνται ακριβείς πληροφορίες για τη σύνθεση του μορίου ϋΝΑ, αλλά είναι απαραίτητο να ληφθούν ορισμένα στατιστικά στοιχεία. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η δομή του νουκλεϊνικού οξέος μπορεί να καταστραφεί με επεξεργασία με απορρυπαντικά, ιδιαίτερα με αλκάλια.
Όλες οι μέθοδοι έρευνας της μοριακής βιολογίας χωρίζονται σε τρεις μεγάλες ομάδες:
1. Ενίσχυση (χρησιμοποιώντας μια ποικιλία ενζύμων). Αυτό περιλαμβάνει την αλυσιδωτή αντίδραση PCR - πολυμεράσης, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές από τις διαγνωστικές μεθόδους.
2. Μη ονομασία. Αυτή η ομάδα μεθόδων σχετίζεται άμεσα με τη λειτουργία μιγμάτων νουκλεϊνικών οξέων. Παραδείγματα είναι 3 τύποι στυπώματος, in situ υβριδισμός, κλπ.
3. Μέθοδοι που βασίζονται στην αναγνώριση ενός σήματος από ένα μόριο ανιχνευτή που συνδέεται με έναν ειδικό ανιχνευτή ϋΝΑ ή RNA. Ένα παράδειγμα είναι ένα σύστημα υβριδισμού σε μια λύση Hybrid Capture System (hc2).
Πολλές μέθοδοι μοριακής διάγνωσης περιλαμβάνουν τη χρήση ευρέος φάσματος ενζύμων. Παρακάτω είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες:
1. Restrictase - "κόβει" το μόριο DNA στα απαραίτητα μέρη.
2. DNA πολυμεράση - συνθέτει ένα δίκλωνο μόριο του δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
3. Αντίστροφη μεταγραφάση (revertase) - χρησιμοποιείται για τη σύνθεση DNA στο RNA matrix.
4. DNA λιγάση - υπεύθυνη για το σχηματισμό δεσμών φωσφοδιεστέρα μεταξύ νουκλεοτιδίων.
5. Εξωνουκλεάση - απομακρύνει νουκλεοτίδια από τα ακραία τμήματα του μορίου του δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι ενεργήχρησιμοποιείται στη σύγχρονη μοριακή βιολογία. Αυτή είναι μια μέθοδος στην οποία ένας τεράστιος αριθμός αντιγράφων μπορεί να ληφθεί από ένα μόνο μόριο ϋΝΑ (να ενισχύσει μόρια).
Οι κύριες λειτουργίες της PCR είναι:
- διάγνωση ασθενειών,
κλωνοποίηση του DNA και των γονιδίων.
Για την πραγματοποίηση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσηςαπαιτεί τα ακόλουθα στοιχεία: αρχική μόριο DNA, μία θερμοσταθερή ϋΝΑ πολυμεράση (Taq ή Pfu), δεοξυριβονουκλεοτίδιο φωσφορικά (πηγές βάσεις αζώτου), τους εκκινητές (Primer 2 1 DNA μόριο) και το ίδιο το ρυθμιστικό σύστημα, το οποίο μπορεί να διενεργεί όλες τις αντιδράσεις.
Η PCR αποτελείται από τρία στάδια: μετουσίωση, ανόπτηση των εκκινητών και επιμήκυνση.
1. Μετουσίωση. Σε θερμοκρασία 94-95 βαθμών Κελσίου, συνεχίζεται η θραύση των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων ϋΝΑ και ως αποτέλεσμα έχουμε δύο μόρια μονής αλυσίδας.
2. Ανόπτηση των εναρκτήρων. Σε μία θερμοκρασία 50-60 βαθμών Κελσίου, οι εκκινητές συνδέονται στα άκρα μορίων νουκλεϊνικού οξέος μονής έλικος με τον τύπο συμπληρωματικότητας.
3. Επιμήκυνση. Σε θερμοκρασία 72 μοίρες, συμβαίνει η σύνθεση θυγατρικών μορίων διπλής έλικος του δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος.
Μοριακές βιολογικές μέθοδοι έρευναςσυχνά απαιτούν γνώση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων σε ένα μόριο δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος. Η ακολουθία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του γενετικού κώδικα. Η μοριακή διάγνωση του μέλλοντος θα βασίζεται στη γνώση που αποκτάται κατά τον προσδιορισμό της ακολουθίας ενός ατόμου.
Οι παρακάτω τύποι αλληλουχίας διακρίνονται:
