Metode molekularnih bioloških istraživanjaigraju važnu ulogu u modernoj medicini, forenzici i biologiji. Zahvaljujući napretku u proučavanju DNA i RNA, osoba je sposobna proučavati genom tijela, odrediti uzročnika bolesti, prepoznati željenu nukleinsku kiselinu u mješavini kiselina, itd.
Još 1970-ih i 1980-ih znanstvenici su prvi uspjelidešifrirati ljudski genom. Ovaj događaj dao je poticaj razvoju genetskog inženjeringa i molekularne biologije. Proučavanje svojstava DNA i RNA dovelo je do činjenice da sada možete koristiti te nukleinske kiseline kako bi dijagnosticirali bolest, proučavali gene.
Molekularno biološke dijagnostičke metodezahtijevaju izvorni materijal: češće su to nukleinske kiseline. Postoji nekoliko načina da se te tvari izoliraju iz stanica živih organizama. Svaki od njih ima svoje prednosti i nedostatke, a to se mora uzeti u obzir pri odabiru metode za izolaciju nukleinskih kiselina u svom čistom obliku.
1. Dobivanje DNA iz Marmura.Metoda se sastoji u obradi smjese supstanci s alkoholom, zbog čega se taloži čista DNA. Nedostatak ove metode je uporaba agresivnih tvari: fenola i kloroforma.
2. Izolacija DNA prema Boomu.Glavna tvar koja se ovdje koristi je gvanidin tiocijanat (GuSCN). Doprinosi taloženju deoksiribonukleinske kiseline na specijaliziranim supstratima, od kojih se kasnije može sakupiti pomoću posebnog pufera. Međutim, GuSCN je inhibitor PTC, pa čak i manji dio koji je ušao u istaloženu DNA može utjecati na tijek lančane reakcije polimeraze, koja igra važnu ulogu pri radu s nukleinskim kiselinama.
3. Odlaganje nečistoća.Metoda se razlikuje od prethodnih po tome što se ne talože nečistoće, nego same molekule deoksiribonukleinske kiseline. Da biste to postigli, koristite ionske izmjenjivače. Nedostatak je u tome što se sve tvari ne mogu taložiti.
4. Masovno pretraživanje.Ova metoda se koristi u slučajevima kada ne trebate točne informacije o sastavu molekule DNA, ali trebate dobiti neke statističke podatke. To se objašnjava činjenicom da se struktura nukleinske kiseline može oštetiti kada se tretira s deterdžentima, osobito s alkalijama.
Sve metode molekularno-bioloških istraživanja podijeljene su u tri velike skupine:
1. Pojačanje (pomoću različitih enzima). To uključuje lančanu reakciju PCR-polimeraze koja igra veliku ulogu u mnogim dijagnostičkim metodama.
2. Ne-pojačanje. Ova skupina metoda izravno je povezana s radom smjese nukleinskih kiselina. Primjeri su 3 vrste upijanja, in situ hibridizacija, itd.
3. Metode temeljene na prepoznavanju signala iz molekule sonde koja se veže na specifičnu DNA ili RNA sondu. Primjer je hibridizacijski sustav hibridnog hvatanja (hc2).
Mnoge molekularne dijagnostičke metode uključuju uporabu širokog raspona enzima. Sljedeće se najčešće koriste:
1. Restrikcijski enzim - “reže” DNA molekulu u potrebne dijelove.
2. DNA polimeraza - sintetizira molekulu dvolančane dezoksiribonukleinske kiseline.
3. Reverzna transkriptaza (reverzna transkriptaza) se koristi za sintezu DNA na RNA predložku.
4. DNA ligaza - odgovorna je za stvaranje fosfodiesterskih veza između nukleotida.
5. Exonuclease - uklanja nukleotide s krajeva molekule dezoksiribonukleinske kiseline.
Aktivna je polimerazna lančana reakcija (PCR)u modernoj molekularnoj biologiji. To je metoda u kojoj se može dobiti veliki broj kopija iz jedne molekule DNA (pojačati molekule).
Glavne funkcije PCR-a:
- dijagnosticiranje bolesti;
- kloniranje DNA, gena.
Za izvođenje lančane reakcije polimerazepotrebni su sljedeći elementi: izvorna DNA molekula, termostabilna DNA polimeraza (Taq ili Pfu), dezoksiribonukleotidni fosfati (izvori dušičnih baza), prajmeri (2 početnice po 1 molekuli DNA) i sam puferski sustav u kojem se mogu provesti sve reakcije.
PCR se sastoji od tri stupnja: denaturacije, kaljenja prajmera i produljenja.
1. Denaturacija. Na temperaturi od 94-95 stupnjeva Celzijusa, dolazi do prekida vodikovih veza između dviju niti DNK, i kao rezultat toga dobivamo dvije jednolančane molekule.
2. Žarenje početnica. Na temperaturi od 50-60 stupnjeva Celzija, prajmeri su vezani na krajevima jednolančanih molekula nukleinske kiseline tipa komplementarnosti.
3. Produženje. Na temperaturi od 72 stupnja dolazi do sinteze kćernih dvolančanih molekula dezoksiribonukleinske kiseline.
Metode molekularnih bioloških istraživanjačesto zahtijevaju poznavanje sekvence nukleotida u molekuli deoksiribonukleinske kiseline. Sekvenciranje se vrši kako bi se odredio genetski kod. Molekularna dijagnostika budućnosti temeljit će se na znanju stečenom u određivanju slijeda osobe.
Razlikuju se sljedeće vrste sekvenciranja:
