Молекулярно-биологические методы исследования มีบทบาทสำคัญในการแพทย์สมัยใหม่นิติเวชและชีววิทยา ต้องขอบคุณความก้าวหน้าในการศึกษา DNA และ RNA บุคคลสามารถศึกษาจีโนมของร่างกายกำหนดตัวแทนสาเหตุของโรคจดจำกรดนิวคลีอิกที่ต้องการในส่วนผสมของกรด ฯลฯ
ย้อนกลับไปในปี 1970 และ 1980 นักวิทยาศาสตร์เป็นคนแรกที่ประสบความสำเร็จเพื่อถอดรหัสจีโนมมนุษย์ เหตุการณ์นี้ให้แรงผลักดันในการพัฒนาพันธุวิศวกรรมและอณูชีววิทยา การศึกษาคุณสมบัติของ DNA และ RNA ได้นำไปสู่ความจริงที่ว่าตอนนี้คุณสามารถใช้กรดนิวคลีอิกเหล่านี้เพื่อวินิจฉัยโรคและศึกษายีน
วิธีการวินิจฉัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุลต้องการวัสดุต้นทาง: ส่วนใหญ่มักเป็นกรดนิวคลีอิก มีหลายวิธีในการแยกสารเหล่านี้ออกจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิต แต่ละคนมีข้อดีและข้อเสียของตัวเองและควรนำมาพิจารณาเมื่อเลือกวิธีการแยกกรดนิวคลีอิกในรูปบริสุทธิ์
1. รับ DNA โดย Marmurวิธีนี้ประกอบด้วยการบำบัดส่วนผสมของสารที่มีแอลกอฮอล์อันเป็นผลมาจากการที่ดีเอ็นเอบริสุทธิ์ตกตะกอน ข้อเสียของวิธีนี้คือการใช้สารก้าวร้าว: ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม
2. การแยกดีเอ็นเอตาม Boom.สารหลักที่ใช้คือ guanidine thiocyanate (GuSCN) ส่งเสริมการสะสมของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกบนพื้นผิวเฉพาะซึ่งสามารถรวบรวมได้ในภายหลังโดยใช้บัฟเฟอร์พิเศษ อย่างไรก็ตาม GuSCN เป็นตัวยับยั้ง PTC และแม้แต่ส่วนเล็ก ๆ ของมันที่เข้าไปใน DNA ที่ตกตะกอนก็สามารถส่งผลต่อปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสซึ่งมีบทบาทสำคัญเมื่อทำงานกับกรดนิวคลีอิก
3. การสะสมของสิ่งสกปรกวิธีการนี้แตกต่างจากวิธีการก่อนหน้านี้ตรงที่ไม่ใช่โมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกที่ตกตะกอน แต่เป็นสิ่งเจือปน เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้จะใช้เครื่องแลกเปลี่ยนไอออน ข้อเสียคือสารบางชนิดไม่สามารถตกตะกอนได้
4. การคัดกรองจำนวนมากวิธีนี้ใช้ในกรณีที่ไม่ต้องการข้อมูลที่แม่นยำเกี่ยวกับองค์ประกอบของโมเลกุลดีเอ็นเอ แต่ต้องได้รับข้อมูลทางสถิติบางอย่าง สิ่งนี้อธิบายได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างของกรดนิวคลีอิกอาจได้รับความเสียหายเมื่อได้รับการบำบัดด้วยผงซักฟอกโดยเฉพาะอย่างยิ่งด่าง
วิธีการวิจัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุลทั้งหมดแบ่งออกเป็นสามกลุ่มใหญ่ ๆ :
1. Amplification (โดยใช้เอนไซม์หลายชนิด) ซึ่งรวมถึง PCR - ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสซึ่งมีบทบาทอย่างมากในวิธีการวินิจฉัยหลายวิธี
2. ไม่ขยายสัญญาณ. วิธีการกลุ่มนี้เกี่ยวข้องโดยตรงกับการทำงานของสารผสมของกรดนิวคลีอิก ตัวอย่าง ได้แก่ blots 3 ชนิดการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิดเป็นต้น
3. วิธีการขึ้นอยู่กับการรับรู้สัญญาณจากโมเลกุลของหัววัดซึ่งจับกับหัววัด DNA หรือ RNA ที่เฉพาะเจาะจง ตัวอย่างคือ Hybride Capture System (hc2)
วิธีการตรวจวินิจฉัยระดับโมเลกุลหลายวิธีเกี่ยวข้องกับการใช้เอนไซม์หลายชนิด ด้านล่างนี้เป็นคำที่ใช้บ่อยที่สุด:
1. จำกัด - "ตัด" โมเลกุลดีเอ็นเอให้เป็นส่วนที่จำเป็น
2. DNA polymerase - สังเคราะห์โมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกสองเส้น
3. Reverse transcriptase (reverse transcriptase) - ใช้ในการสังเคราะห์ DNA บนแม่แบบ RNA
4. DNA ligase - รับผิดชอบในการสร้างพันธะ phosphodiester ระหว่างนิวคลีโอไทด์
5. Exonuclease - กำจัดนิวคลีโอไทด์จากปลายโมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ทำงานอยู่ใช้ในอณูชีววิทยาสมัยใหม่ นี่เป็นวิธีการที่สามารถรับสำเนาจำนวนมากได้จากโมเลกุลดีเอ็นเอหนึ่งโมเลกุล (ขยายโมเลกุล)
หน้าที่หลักของ PCR:
- การวินิจฉัยโรค
- การโคลนส่วนดีเอ็นเอยีน
เพื่อทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสจำเป็นต้องมีองค์ประกอบต่อไปนี้: โมเลกุล DNA ดั้งเดิม, DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ (Taq หรือ Pfu), ฟอสเฟต deoxyribonucleotide (แหล่งที่มาของฐานไนโตรเจน), ไพรเมอร์ (ไพรเมอร์ 2 ตัวต่อ 1 โมเลกุล DNA) และระบบบัฟเฟอร์เองซึ่งปฏิกิริยาทั้งหมดสามารถเกิดได้ ดำเนินการ.
PCR ประกอบด้วยสามขั้นตอน ได้แก่ การเปลี่ยนสภาพการเคลือบสีรองพื้นและการยืด
1. Denaturation. ที่อุณหภูมิ 94-95 องศาเซลเซียสการแตกของพันธะไฮโดรเจนระหว่างดีเอ็นเอสองเส้นจะเกิดขึ้นและเป็นผลให้เราได้โมเลกุลที่มีเกลียวเดี่ยวสองโมเลกุล
2. การอบไพรเมอร์ ที่อุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียสไพรเมอร์จะติดอยู่ที่ปลายของโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกแบบเกลียวเดี่ยวตามประเภทของความสมบูรณ์
3. การยืดตัว ที่อุณหภูมิ 72 องศาการสังเคราะห์โมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกแบบเกลียวคู่ของลูกสาวจะเกิดขึ้น
วิธีการวิจัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุลมักต้องการความรู้เกี่ยวกับลำดับนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก ลำดับจะดำเนินการเพื่อกำหนดรหัสพันธุกรรม การวินิจฉัยระดับโมเลกุลในอนาคตจะขึ้นอยู่กับความรู้ที่ได้รับจากการจัดลำดับของมนุษย์
การจัดลำดับประเภทต่อไปนี้มีความโดดเด่น:
