Для вивчення і виявлення варіантів в структуріДНК застосовується молекулярно-генетичний метод. Для кожної ділянки ДНК, який досліджується, регіон це хромосоми, ген або аллель, методи відрізняються. В основі кожного молекулярно-генетичний метод містить ті чи інші маніпуляції з РНК і ДНК. Всі ці методи відрізняються величезною складністю, без лабораторних умов проводитися не можуть, і персонал повинен бути висококваліфікований. Проводиться ця робота в кілька етапів.
Спочатку зразки РНК або ДНК потрібно отримати.Тут молекулярно-генетичний метод може застосовуватися по відношенню до практично будь-якого матеріалу: крапля крові, лейкоцити, культура фибропластов, слизова оболонка (зішкріб), навіть волосяні цибулини, - ДНК можна отримати з будь-якого зразка. Вона придатна для того, щоб застосувати будь-молекулярно-генетичний метод і різні їх варіанти, а вже виділена ДНК довго зберігається в заморожуванні. Другий етап присвячений накопичення потрібних фрагментів (ампліфікації) ДНК, забезпечити же його допомагає ланцюгова полімеразна реакція in vitro (у пробірці, без участі живого організму). В результаті обраний фрагмент ДНК розмножується за допомогою цієї ланцюгової реакції, і кількість ДНК зростає буквально в мільйон разів.
Третім етапом молекулярно-генетичних методівдослідження передбачається рестрикция розмножених ДНК (це фрагментованість, розривання або розрізання). Рестрикція проводиться за допомогою електрофорезу на полиакриламидном або агарозному гелі. Цей молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК дозволяє кожному фрагменту зайняти в гелі певне положення. Після цього гель обробляється етидієм броміду, здатним зв'язуватися в ДНК, проводиться опромінення ультрафіолетом, після чого можна спостерігати ділянки світіння. Молекулярно-генетичні методи діагностики різноманітні і численні, однак перші два етапи характерні для всіх. А ось для того, щоб виявити фрагменти ДНК, гель можна фарбувати і багатьма іншими існуючими способами.
До самим прямим і поширеним способамвиявлення мікобактерій можна віднести вищеописаний молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК. Сутність його полягає в тому, щоб виявити в діагностичному матеріалі специфічні фрагменти ланцюжка ДНК-збудників. Молекулярно-генетичні методи діагностики поки не мають більш ефективного способу розпізнавати таке захворювання, як туберкульоз. Застосовуючи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), можна бути впевненим, що вихідна ДНК збільшить кількість копій в мільйон разів, тобто відбудеться ампліфікація, і це дозволить візуалізувати результати. Рівень чутливості тут дуже високий - понад дев'яносто п'яти відсотків, що і є головною перевагою даного методу.
Решта молекулярно-генетичні методидослідження по ефективності поступаються багаторазового копіювання буквально вдвічі, оскільки в цьому випадку редакційна проба показує специфічну олігонуклеотидних послідовність зрослої в сто шість разів. Навіть культуральная діагностика туберкульозу органів дихання значно нижче за своєю чутливості. Саме тому сучасна медицина спирається на молекулярно-генетичні методи діагностики туберкульозу. А описаний метод особливо ефективний при зустрічі зі збудниками високою антигенною мінливості, визначити які іншим способом набагато складніше - потрібні особливі поживні середовища та тривалий час культивування. Біохімічний і молекулярно-генетичний методи дають абсолютно різні за ефектом результати.
Вибудовують ПЛР-діагностику туберкульозу найбільшчасто з використанням тих послідовностей ДНК, які специфічні для всіх чотирьох видів цього захворювання. Для досягнення поставленої мети найчастіше використовують праймери, що виявляють послідовності IS елементів (IS-986, IS-6110), так як ці мігруючі елементи характеризують суто види мікобактерій туберкульозу і завжди присутні декількома копіями в геномі. Також виділення ДНК можна здійснити з чистих культур і клінічних (мокрота хворих) будь-яким іншим прийнятним методом. Наприклад, є метод Boom, де використовується лізуючий буфер на основі гуанідину, двоокису кремнію і тіоционату як носія ДНК. Число хворих, що відрізняються мізерним бактеріовиділенням, з кожним роком збільшується, і тому в клінічній практиці утвердився зовсім інший рівень організації: молекулярно-генетичний метод вивчення ДНК грає вже головну роль в діагностиці.
Однак потрібно визнати, що і він не безнедоліків. Застосування ПЛР-методу часто приносить величезну кількість хибнопозитивних результатів, і виною тут не лише технічні похибки, але і особливості самого методу. Крім усього іншого, за допомогою даного способу діагностики визначити ступінь життєздатності мікобактерій, які виявлені, просто неможливо. Але і цей недолік не найголовніший. Молекулярно-генетичні методи ПЛР-діагностики тягнуть за собою небезпеку контамінації мікобактеріальних ДНК. Сертифікаційні вимоги з цієї причини для ПЛР-лабораторій розроблені виключно жорсткі, вони вимагають наявності трьох ізольованих приміщень. Технологія ПЛР сучасна і дуже складна, її використання вимагає відповідної апаратури і висококлассно підготовленого персоналу.
При встановленні діагнозу результатиПЛР-дослідження обов'язково повинні зіставлятися з іншими даними: клінічне обстеження, рентгенографія, мікроскопія мазка, посів і навіть відповідь на специфічне лікування тут дуже важливі. У цьому ряду досліджень ПЦР є тільки одним з компонентів. Виявити збудник в самому початку діагностики можна найбільш простими і швидкими методами - бактеріологічними.
Тут використовується світловий мікроскоп (забарвлення поЦіль-Нільсеном) і люмінесцентний (забарвлення флюорохромами). Перевагою бактеріоскопії є швидкість отримання результатів. А недоліком її справедливо вважається обмеженість можливостей через низьку чутливості. Однак саме цього методу віддана рекомендація ВООЗ як найбільш економічного і основного для виявлення хворих на туберкульоз. Виявлення мікобактерій бактеріологічним методом має значення прогнозу, і оцінюється бактеріовиділення кількісно. Набагато впевненіше з цим справляються молекулярно-генетичні методи дослідження туберкульозу.
Кращим виявленням мікобактерій визнаютькультуральні дослідження. Посів патологічного матеріалу проводиться в яєчні середовища: Мордовського, Фінна II, Левенштейна-Йенсена і тому подібні. Орієнтовним показником розвитку стійкості мікобактерій до препаратів і непрямим свідченням ефективності є кількість мікобактерій або їх колоній в пробірці, якщо застосований культуральний метод дослідження. Щоб підвищити відсоток виділення мікобактерій, посів патологічного матеріалу проводиться на кілька середовищ.
Задовольняючи численні культуральніпотреби, збудника в тому числі надають і рідкі середовища. Використовуються при цьому і автоматизовані системи обліку зростання типу ВАНТЕС. Посіви повинні провести в інкубації до семи-восьми тижнів. До цього часу посів з відсутністю зростання можна вважати негативним. Найдієвішим способом виявлення мікобактерій туберкульозу вважають біологічні проби: заражають діагностичним матеріалом морських свинок, які до туберкульозу надзвичайно чутливі.
Найцікавішою областю дослідження, якавідкрилася допомогою ПЛР-діагностики, стало вивчення M. tuberculosis - латентної інфекції. Сучасна концепція туберкульозної інфекції говорить про те, що зі ста чоловік, які перебували в контакті з M. tuberculosis, дев'яносто цілком можуть інфікуватися, але тільки у десяти з них активна хвороба отримує розвиток. Решта мають протитуберкульозний імунітет, і тому в дев'яноста відсотках випадків інфекція залишиться латентної. Виявити таку закономірність допоміг саме молекулярно-генетичний метод.
Генетики стверджують, що п'ятдесят п'ять відсотківосіб, у яких посіви патологічного матеріалу були негативними, і вісімдесят відсотків осіб, заражених M. tuberculosis, але з плинною без будь-яких рентгенографічних проявів хворобою, відповіді ПЛР отримали позитивні. Саме генетичний метод діагностики допоміг виявити хворих з груп ризику за допомогою ПЛР-досліджень, причому результати їх аналізів (мікроскопія і посіви) були негативними, а субклінічна інфекція M. tuberculosis була присутня.
Бактеріологічні лабораторії РосійськоїФедерації використовують і прискорений метод абсолютних концентрацій: тестується нітратредуктазная активність мікобактерій за допомогою реактиву Грісса. Протитуберкульозні центри користуються методом, який дозволяє визначити лікарську стійкість. Це посів в рідкі середовища, де автоматизована радіометричну і флюоресцентная система обліку зростання мікобактерій. Такий аналіз робиться швидко - до двох тижнів.
В даний час і нові методи розробляються:лікарська стійкість мікобактерій оцінюється на рівні генотипу. Вивчення молекулярних механізмів резистентності показує наявність генів і у мікобактерій. Гени ці пов'язані зі стійкістю до певних препаратів. Наприклад, гени kasA, inhA, katG стійкі до ізоніазиду, ген rpoB - до рифампіцину, гени 16Sp РНК і rpsL - до стрептоміцину, emb1 - до етамбутолу, gyrA - до фторхінолонів і так далі.
У сучасній діагностиці значно підвищивсямолекулярно-генетичний рівень методу вивчення ДНК і дозволив проводити широкомасштабні дослідження мутацій у всьому їх спектрі. Тепер ми знаємо, що найбільш поширені мутації в 516, 526 і 531 кодонах гена rpoB, а також виявлені стійкості до різних препаратів. Існує цілий комплекс методів для типування мікобактерій з використанням не тільки методів традиційних - біохімічних, біологічних і культуральних, але широко застосовуються і сучасні молекулярно-генетичні методи. Вже існують адекватні та забезпечують вірну діагностику методики виявлення моногенних хвороб. Вони грунтуються на дослідженнях ДНК в точній районі певного гена. Це, як правило, процес складний, трудомісткий і дорогий, зате дані, які надають методи молекулярно-генетичного аналізу, значно більш точні і інформативні, ніж дані всіх інших аналізів.
Давно відомо, що ДНК не змінюється за всюжиття організму, що вона в будь-який ядерний клітці однаково, і це дає можливість брати на аналіз абсолютно будь-які клітини організму, на будь-яких стадіях онтогенезу. Пошкоджений ген можна виявити до появи перших симптомів, до розгорнутої клініки захворювання, а також у здорових гетерозиготних людей, але мають в гені мутацію. Молекулярно-генетичні методи діагностики спадкових хвороб дозволяють виявити її (прямим підходом ДНК-діагностики), а також проаналізувати сегрегацію захворювання в родині з маркерними локусами ДНК (поліморфними ділянками), які тісно зчеплені з пошкодженим геном (тобто непрямим підходом ДНК-діагностики). Пряма або непряма - будь-яка ДНК-діагностика грунтується на методах, що ідентифікують строго певну ділянку ДНК людини.
Прямими методами ДНК-діагностики користуються ввипадках, коли ген-винуватець спадкового захворювання відомий, а також відомі і типи його мутацій. Наприклад, доцільні прямі методи при цілому ряді захворювань. Це хорея Гентингтона (розширення CTG-повторів), фенілкетонурія (R408W), муковісцидоз (delF508, мажорна мутація) і тому подібні. Головною перевагою прямого методу є стовідсоткова точність діагностики, а також немає необхідності робити ДНК-аналіз решті сім'ї. Якщо мутація в відповідному гені виявлено, це дозволяє абсолютно точно затвердити діагноз спадковості, визначити генотип для решти обтяженою сім'ї.
Іншою перевагою прямої діагностики вважаєтьсявиявлення гетерозиготного носійства нехороших мутацій у родичів і батьків померлого від хвороби. Це особливо актуально для захворювань аутосомно-рецесивних. Недоліки у прямих методів теж є. Щоб їх застосувати, потрібно точно знати локалізацію патологічного гена, екзон-інтрон його структуру і спектр його мутацій. Далеко не всі моногенні хвороби сьогодні отримали подібну інформацію. Інформативність прямих методів не може вважатися повною, оскільки один і той же ген може мати велику кількість патологічних мутацій, що й обумовлює розвиток спадкових хвороб.
Непрямі методи в ДНК-діагностики застосовуютьсязовсім в інших випадках: якщо пошкоджений ген не ідентифіковано, а всього лише локалізована на хромосомі, або якщо пряма діагностика не дала результату (це буває, якщо у гена складна молекулярна організація або значна протяжність, якщо в ньому багато патологічних мутацій). Непрямими методами проводиться аналіз сегрегації поліморфних маркерів в родині алелей. Маркери знаходяться в цьому ж хромосомному районі або тісно зчеплені з локусом захворювання і являють собою делеции або инсерции, точкові заміни, повтори, а їх поліморфізм обумовлений різною кількістю в блоці елементів.
Найзручнішими для непрямої діагностикивважаються Микросателлитная і мінісателлітние поліморфні маркери, які широко поширені в геномі людини. Цінність їх виражається у високій інформативності, якщо генетична відстань між пошкодженням в гені і маркером не надається занадто великим. В останньому випадку точність оцінки визначається у великій мірі частотою рекомбінації між поліморфним маркером і пошкодженням. Непрямі методи діагностики також передбачають обов'язковий попередній етап дослідження частоти алелів аналізованих популяцій серед носіїв мутацій і хворих, плюс до цього необхідність визначення ймовірності нерівноваги і рекомбінації зчеплення маркерів і мутантних алелів гена.
Короткі сегменти РНК або ДНК, а також окремийген при мікроскопічному дослідженні визуализирован бути не може, тому, щоб ідентифікувати мутації, необхідні методи молекулярно-генетичної діагностики. Існуючий "Проект геному людини", як і інші досягнення молекулярної генетики, багато в чому розширив можливість діагностики спадкових захворювань - як пре-, так і постнатальної. Ці методи можуть забезпечити раннє виявлення і зробити прогноз полі- і моногенних хвороб, у яких дебют відбувається в дорослому віці. На жаль, за технічними можливостями молекулярно-генетичні дослідження іноді виходять за етичні рамки, які встановлені щодо спадковості, особливо коли діагностика проводиться в підлітковому і дитячому віці.
Структурні і кількісні аномалії хромосомє найпоширенішими причинами і онкологічних захворювань, і багатьох пороків розвитку. Хромосомніаберації необхідно ідентифікувати, що важливо для сімейного консультування - дати оцінку прогнозу поряд з репродуктивним ризиком при майбутніх вагітностях. Хромосомний аналіз є "золотим стандартом" генетичної діагностики, але і у нього можливості обмежені. Тільки методи молекулярно-генетичного аналізу можуть зробити більше, тому що там застосовуються засновані технологіями клонування флюоресцирующие мітки, здатні з їх високою чутливістю виявити тонкі хромосомні зміни, які неможливо виявити класичним цитогенетичним дослідженням. Ці техніки все більш розширюють наші діагностичні можливості, коли обстежуються діти з вадами розвитку, з розумовою відсталістю, з багатьма іншими спадковими захворюваннями.
Дуже важливими для людства з'явилися знанняструктури і функцій генів, видів їх мінливості, вміння розпізнавати спадкові хвороби, що сталося в зв'язку з розвитком молекулярної генетики. Методи її спрямовані на дослідження молекули ДНК - і коли вона знаходиться в нормі, і при пошкодженні її. Отримання послідовностей нуклеотидів дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) проходить поетапно від отримання зразків до ідентифікації окремих фрагментів. Виділення геномної ДНК з клітин, рестрикция (розривання), ампліфікація (клонування), електрофорез фрагментів (поділ їх по електричному заряду і молекулярної масі з допомогою агарозного гелю). Ідентифікація певних фрагментів, розташованих на його поверхні дискретною смугою.
Потім в справу вступають спеціальні фільтри, здопомогою яких проходить гібридизація кожного фрагмента з клонованими фрагментами ДНК або з синтетичними радіоактивними зондами, які є контрольними, за якими і буде дорівнювати кожен досліджуваний фрагмент. Якщо змінилося становище або його довжина порівняно з зондом, якщо з'явився новий фрагмент або зник, - все це говорить про те, що досліджуваний ген піддався перебудові в послідовності нуклеотидів. Існує вісім основних методів молекулярно-генетичного дослідження: секвенування (визначення послідовності ДНК), полімеразна ланцюгова реакція (збільшення числа послідовностей), отримання праймерів відомих генів, клонування ДНК, отримання рекомбінантних молекул, отримання білків за рахунок рекомбінантних молекул, створення повного набору (колекції, бібліотеки) клонованих фрагментів, які вийшли з допомогою рестрикції.
