Explorar e identificar opciones en la estructura.Se aplica el ADN al método genético molecular. Para cada región de ADN que se está investigando, una región es un cromosoma, un gen o un alelo, los métodos son diferentes. En el corazón de cada método genético molecular se encuentran ciertas manipulaciones con ARN y ADN. Todos estos métodos son extremadamente complejos, no pueden realizarse sin condiciones de laboratorio y el personal debe estar altamente calificado. Este trabajo se realiza en varias etapas.
Primero, se deben obtener muestras de ARN o ADN.Aquí, el método genético molecular se puede aplicar a prácticamente cualquier material: una gota de sangre, glóbulos blancos, cultivo de fibroblastos, membrana mucosa (raspado), incluso folículos pilosos: se puede obtener ADN de cualquier muestra. Es adecuado para la aplicación de cualquier método genético molecular y sus diversas variantes, y el ADN ya aislado se almacena durante mucho tiempo en una congelación. La segunda etapa está dedicada a la acumulación de los fragmentos necesarios (amplificación) del ADN, mientras que la reacción en cadena de la polimerasa in vitro (in vitro, sin la participación de un organismo vivo) ayuda a asegurarla. Como resultado, el fragmento de ADN seleccionado se multiplica utilizando esta reacción en cadena, y la cantidad de ADN aumenta literalmente un millón de veces.
La tercera etapa de los métodos genéticos moleculares.la investigación sugiere la restricción del ADN multiplicado (esto es fragmentación, rasgado o corte). La restricción se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida o agarosa. Este método genético molecular de estudiar el ADN permite que cada fragmento tome una cierta posición en el gel. Después de esto, el gel se trata con bromuro de etidio, capaz de unirse al ADN, se lleva a cabo una irradiación ultravioleta, después de lo cual es posible observar las regiones brillantes. Los métodos de diagnóstico genético molecular son diversos y numerosos, pero las dos primeras etapas son comunes para todos. Pero para identificar fragmentos de ADN, el gel puede teñirse de muchas otras formas existentes.
A los métodos más directos y comunes.La detección de micobacterias puede atribuirse al método genético molecular descrito anteriormente para el estudio del ADN. La esencia de esto es identificar en el material de diagnóstico fragmentos específicos de una cadena de patógenos de ADN. Los métodos de diagnóstico genético molecular aún no tienen una forma más efectiva de reconocer una enfermedad como la tuberculosis. Al utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), puede estar seguro de que el ADN original aumentará el número de copias un millón de veces, es decir, se producirá una amplificación y esto le permitirá visualizar los resultados. El nivel de sensibilidad aquí es muy alto: más del noventa y cinco por ciento, que es la principal ventaja de este método.
Los restantes métodos genéticos moleculares.Los estudios de eficiencia son, literalmente, dos veces más lentos que la copia múltiple, ya que en este caso la muestra editorial muestra una secuencia de oligonucleótidos específica que ha aumentado ciento seis veces. Incluso el diagnóstico cultural de la tuberculosis respiratoria es significativamente menor en su sensibilidad. Es por eso que la medicina moderna se basa en métodos genético-moleculares para diagnosticar la tuberculosis. Y el método descrito es especialmente efectivo cuando se encuentra con patógenos de alta variabilidad antigénica, que es mucho más difícil de determinar por otros medios: se requieren medios nutritivos especiales y un largo tiempo de cultivo. Los métodos bioquímicos y genéticos moleculares dan resultados completamente diferentes.
Выстраивают ПЦР-диагностику туберкулёза наиболее a menudo se utilizan las secuencias de ADN que son específicas para los cuatro tipos de esta enfermedad. Para lograr este objetivo, se utilizan con mayor frecuencia los cebadores que identifican la secuencia de elementos IS (IS-986, IS-6110), ya que estos elementos migratorios caracterizan a las especies puramente mycobacterium tuberculosis y siempre están presentes en varias copias del genoma. La extracción de ADN también se puede realizar a partir de cultivos puros y clínicos (esputo de pacientes) mediante cualquier otro método aceptable. Por ejemplo, existe el método Boom, que utiliza un tampón de lisis basado en guanidina, sílice y tiocianato como portador de ADN. El número de pacientes que se distinguen por su pobre excreción bacteriana aumenta cada año y, por lo tanto, se ha establecido un nivel de organización completamente diferente en la práctica clínica: el método genético-molecular para estudiar el ADN ya desempeña un papel importante en el diagnóstico.
Sin embargo, hay que admitir que no le faltadeficiencias. El uso del método de PCR a menudo trae una gran cantidad de resultados falsos positivos, y la falla aquí no es solo errores técnicos, sino también las características del método en sí. Además, usar este método de diagnóstico para determinar el grado de viabilidad de las micobacterias, que se identifican, es simplemente imposible. Pero esta deficiencia no es la más importante. Los métodos genéticos moleculares de los diagnósticos de PCR conllevan el riesgo de contaminación del ADN micobacteriano. Los requisitos de certificación por este motivo para los laboratorios de PCR son extremadamente rígidos, requieren tres salas aisladas. La tecnología de PCR es moderna y muy compleja, su uso requiere equipo apropiado y personal altamente capacitado.
Al establecer los resultados del diagnóstico.Los estudios de PCR deben compararse con otros datos: el examen clínico, los rayos X, la microscopía de frotis, la siembra e incluso la respuesta a un tratamiento específico son muy importantes aquí. En esta serie de estudios, la PCR es solo un componente. Detectar el patógeno al comienzo del diagnóstico puede ser el método más simple y rápido: bacteriológico.
Utiliza un microscopio de luz (color porZiehl-Nielsen) y luminiscentes (fluorocromos de color). La ventaja de la bacterioscopia es la velocidad de obtención de resultados. Una desventaja de esto se considera justamente oportunidades limitadas debido a la baja sensibilidad. Sin embargo, es precisamente este método el que recibe la recomendación de la OMS como la más económica y esencial para identificar a los pacientes con tuberculosis. La detección de micobacterias por el método bacteriológico tiene un valor pronóstico y la excreción bacteriana se evalúa cuantitativamente. Mucho más seguro con estos métodos genéticos moleculares de afrontamiento para el estudio de la tuberculosis.
Se reconoce la mejor detección de micobacterias.estudios de cultura. Siembra de material patológico producido en el medio de huevo: Mordovsky, Finn II, Levenshteyn-Jensen y similares. Un indicador indicativo del desarrollo de la resistencia de las micobacterias a los medicamentos y la evidencia indirecta de la efectividad es el número de micobacterias o sus colonias en el tubo de ensayo, si se aplica el método de investigación de cultivo. Para aumentar el porcentaje de excreción de micobacterias, la siembra de material patológico se realiza en varios medios.
Удовлетворяя многочисленные культуральные Las necesidades, el agente causal, incluido el suministro y los medios líquidos. En este caso, también se utilizan sistemas automatizados de contabilidad de crecimiento del tipo VANTES. Los cultivos deben incubarse por hasta siete u ocho semanas. A estas alturas, la siembra sin crecimiento puede considerarse negativa. Las muestras biológicas se consideran la forma más eficaz de detectar Mycobacterium tuberculosis: infectan a los cobayas con material de diagnóstico que es extremadamente sensible a la tuberculosis.
El área de estudio más interesante queAbierto por diagnóstico de PCR, fue el estudio de M. tuberculosis, una infección latente. El concepto moderno de infección de tuberculosis sugiere que de cada cien personas que estuvieron en contacto con M. tuberculosis, noventa podrían infectarse, pero solo en diez de ellas se desarrolla la enfermedad activa. El resto tiene inmunidad contra la tuberculosis y, por lo tanto, en el noventa por ciento de los casos la infección permanecerá latente. Fue el método genético molecular que ayudó a descubrir este patrón.
Генетики утверждают, что пятьдесят пять процентов Las personas con un cultivo de material patológico fueron negativas, y el ochenta por ciento de las personas infectadas con M. tuberculosis, pero con una enfermedad que progresa sin manifestaciones radiográficas, recibió respuestas de PCR positivas. Fue el método genético de diagnóstico el que ayudó a identificar a los pacientes de los grupos de riesgo que utilizaron estudios de PCR, y los resultados de sus análisis (microscopía y cultivo) fueron negativos y la infección subclínica de M. tuberculosis estuvo presente.
Laboratorio bacteriológico del ruso.Las federaciones utilizan el método acelerado de concentraciones absolutas: la actividad nitrorreductasa de las micobacterias se prueba mediante el reactivo de Griess. Los centros de tuberculosis utilizan un método que permite determinar la resistencia a los medicamentos. Se está sembrando en medios líquidos en los que se automatiza el sistema de contabilidad de crecimiento micobacteriano radiométrico y micobacteriano. Este análisis se realiza rápidamente, hasta dos semanas.
Actualmente, se están desarrollando nuevos métodos:La resistencia farmacológica de las micobacterias se evalúa a nivel de genotipo. El estudio de los mecanismos moleculares de resistencia muestra la presencia de genes en micobacterias. Estos genes están asociados con la resistencia a ciertos fármacos. Por ejemplo, los genes kasA, inhA, katG son resistentes a la isoniazida, el gen rpoB a la rifampicina, los genes 16Sp RNA y rpsL a la estreptomicina, emb1 a etambutol, gyrA a fluoroquinolona, etc.
En los diagnósticos modernos aumentó significativamenteNivel genético molecular del método de estudio de ADN y permitió realizar estudios a gran escala de mutaciones en todo su espectro. Ahora sabemos que las mutaciones en los codones 516, 526 y 531 del gen rpoB son las más comunes, y se ha identificado resistencia a varios fármacos. Existe una amplia gama de métodos para la tipificación de micobacterias que utilizan no solo los métodos tradicionales, bioquímicos, biológicos y culturales, sino que los métodos genéticos moleculares modernos son ampliamente utilizados. Ya existen y aseguran los métodos de diagnóstico correctos para la detección de enfermedades monogénicas. Se basan en estudios de ADN en la región exacta de un gen en particular. Esto, como regla general, es un proceso complejo, lento y costoso, pero los datos proporcionados por los métodos de análisis genético molecular son mucho más precisos e informativos que los datos de todos los demás análisis.
Давно известно, что ДНК не изменяется за всю La vida del organismo, que está en cualquier célula nuclear, sin embargo, y esto permite tomar para el análisis absolutamente cualquier célula del cuerpo, en cualquier etapa de la ontogénesis. Se puede detectar un gen dañado antes del inicio de los primeros síntomas, antes de una clínica integral de la enfermedad, así como en personas heterocigotas sanas, pero con una mutación en el gen. Los métodos genéticos moleculares para diagnosticar enfermedades hereditarias lo revelan (enfoque de diagnóstico directo de ADN) y analizan la segregación de la enfermedad en una familia con loci marcadores de ADN (regiones polimórficas) que están estrechamente relacionados con el gen dañado (es decir, un enfoque de diagnóstico de ADN indirecto). Directo o indirecto: cualquier diagnóstico de ADN se basa en métodos que identifican un segmento estrictamente definido del ADN humano.
Прямыми методами ДНК-диагностики пользуются в Se conocen los casos en que se conoce al culpable de la enfermedad hereditaria, así como los tipos de sus mutaciones. Por ejemplo, los métodos directos son recomendables para una serie de enfermedades. Estos son la corea de Huntington (extensión de las repeticiones CTG), fenilcetonuria (R408W), fibrosis quística (delF508, mutación mayor) y similares. La principal ventaja del método directo es la precisión absoluta del diagnóstico, y no es necesario realizar un análisis de ADN del resto de la familia. Si se encuentra una mutación en el gen correspondiente, esto le permite confirmar con absoluta precisión el diagnóstico de herencia, determinar el genotipo para el resto de la familia cargada.
Se considera otra ventaja del diagnóstico directo.identificación del transporte heterocigoto de mutaciones malas en parientes y padres de los fallecidos por la enfermedad. Esto es especialmente cierto para las enfermedades autosómicas recesivas. Los métodos directos también tienen desventajas. Para aplicarlos, necesita saber exactamente la ubicación del gen patológico, su estructura exón-intrón y el espectro de sus mutaciones. No todas las enfermedades monogénicas hoy recibieron información similar. El contenido informativo de los métodos directos no puede considerarse completo, ya que el mismo gen puede tener una gran cantidad de mutaciones patológicas, lo que determina el desarrollo de enfermedades hereditarias.
Se utilizan métodos indirectos en el diagnóstico de ADN.en casos completamente diferentes: si el gen dañado no se identifica, sino que solo se localiza en el cromosoma, o si el diagnóstico directo no dio un resultado (esto sucede si el gen tiene una organización molecular compleja o una longitud significativa, si tiene muchas mutaciones patológicas). Los métodos indirectos se utilizan para analizar la segregación de marcadores polimórficos en la familia de alelos. Los marcadores se encuentran en la misma región cromosómica o están estrechamente relacionados con el locus de la enfermedad y representan deleciones o inserciones, reemplazos de puntos, repeticiones y su polimorfismo se debe a diferentes cantidades en el bloque de elementos.
El más conveniente para el diagnóstico indirecto.Se consideran marcadores polimórficos de microsatélites y minisatélites que están muy extendidos en el genoma humano. Su valor se expresa en alto contenido de información si la distancia genética entre el daño en el gen y el marcador no es demasiado grande. En el último caso, la precisión de la evaluación está determinada en gran medida por la frecuencia de recombinación entre el marcador polimórfico y el daño. Los métodos de diagnóstico indirectos también proporcionan una etapa preliminar obligatoria para estudiar la frecuencia de los alelos de las poblaciones analizadas entre portadores de mutaciones y pacientes, además de la necesidad de determinar la probabilidad de desequilibrio y recombinación de la unión de marcadores y alelos de genes mutantes.
Segmentos cortos de ARN o ADN, así como un segmento separadono se puede visualizar un examen microscópico de un gen; por lo tanto, se necesitan diagnósticos genéticos moleculares para identificar mutaciones. El "Proyecto del Genoma Humano" existente, al igual que otros avances en genética molecular, ha ampliado enormemente la capacidad de diagnosticar enfermedades hereditarias, tanto prenatales como posnatales. Estos métodos pueden proporcionar detección temprana y pronóstico de enfermedades poligénicas y monogénicas en las cuales el debut ocurre en la edad adulta. Desafortunadamente, en términos de capacidades técnicas, los estudios de genética molecular a veces van más allá del marco ético establecido con respecto a la herencia, especialmente cuando el diagnóstico se lleva a cabo en la adolescencia y la infancia.
Anomalías cromosómicas estructurales y cuantitativas.son las causas más comunes de cáncer y muchas malformaciones. Deben identificarse las aberraciones cromosómicas, lo cual es importante para el asesoramiento familiar, para evaluar el pronóstico junto con el riesgo reproductivo en futuros embarazos. El análisis cromosómico es el "estándar de oro" del diagnóstico genético, pero también tiene capacidades limitadas. Solo los métodos de análisis genético molecular pueden hacer más, porque usan marcadores fluorescentes basados en tecnologías de clonación que pueden detectar cambios cromosómicos sutiles que no pueden ser detectados por los estudios citogenéticos clásicos con su alta sensibilidad. Estas técnicas están expandiendo cada vez más nuestras capacidades de diagnóstico al examinar a niños con defectos de desarrollo, retraso mental y muchas otras enfermedades hereditarias.
El conocimiento era muy importante para la humanidad.la estructura y funciones de los genes, sus tipos de variabilidad, la capacidad de reconocer enfermedades hereditarias, que ocurrieron en relación con el desarrollo de la genética molecular. Sus métodos están destinados a estudiar una molécula de ADN, tanto cuando es normal como cuando está dañada. La obtención de secuencias de nucleótidos de ácido desoxirribonucleico (ADN) se realiza en etapas desde la obtención de muestras hasta la identificación de fragmentos individuales. Aislamiento de ADN genómico de las células, restricción (ruptura), amplificación (clonación), electroforesis de fragmentos (separación de ellos por carga eléctrica y peso molecular usando un gel de agarosa). Identificación de ciertos fragmentos ubicados en su superficie con una tira discreta.
Luego entran en juego filtros especiales, concon la ayuda de la cual cada fragmento se hibrida con fragmentos de ADN clonados o con sondas radiactivas sintéticas, que son el control, según el cual cada fragmento estudiado será igual. Si la posición o su longitud ha cambiado en comparación con la sonda, si un nuevo fragmento ha aparecido o desaparecido, todo esto sugiere que el gen estudiado sufrió un reordenamiento en la secuencia de nucleótidos. Existen ocho métodos principales de investigación genética molecular: secuenciación (determinación de la secuencia de ADN), reacción en cadena de la polimerasa (aumento del número de secuencias), obtención de cebadores de genes conocidos, clonación de ADN, obtención de moléculas recombinantes, obtención de proteínas utilizando moléculas recombinantes, creación de un conjunto completo (colecciones, bibliotecas) de fragmentos clonados obtenidos por restricción.
