Métodos de investigación biológicos molecularesjuega un gran papel en la medicina moderna, criminalística y biología. Gracias a los avances en el campo de los estudios de ADN y ARN, una persona puede estudiar el genoma del organismo, identificar el agente causal de la enfermedad, reconocer el ácido nucleico deseado en una mezcla de ácidos, etc.
Ya en la década de 1970 y 1980, los científicosdescifrar el genoma humano Este evento impulsó el desarrollo de la ingeniería genética y la biología molecular. El estudio de las propiedades del ADN y el ARN llevó al hecho de que ahora es posible usar estos ácidos nucleicos para diagnosticar la enfermedad, para estudiar genes.
Métodos biológicos moleculares de diagnósticorequieren la presencia de material de partida: con mayor frecuencia son ácidos nucleicos. Hay varias formas de aislar estas sustancias de las células de los organismos vivos. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas, y esto debe tenerse en cuenta al elegir el método de aislamiento de ácidos nucleicos en forma pura.
1. Preparación de ADN según Marmur.El método consiste en tratar la mezcla de sustancias con alcohol, como resultado de lo cual precipita el ADN puro. La desventaja de este método es el uso de sustancias agresivas: fenol y cloroformo.
2. Aislamiento de ADN por Boom.La sustancia básica utilizada aquí es guanidina tiocianato (GuSCN). Promueve la deposición de ácido desoxirribonucleico en sustratos especializados, de los que posteriormente se puede recolectar con un tampón especial. Sin embargo, GuSCN es un inhibidor de PTC, e incluso una pequeña parte de él, atrapada en el ADN precipitado, puede afectar el curso de la reacción en cadena de la polimerasa, que desempeña un papel importante en el trabajo con ácidos nucleicos.
3. Precipitación de impurezas.El método difiere de los anteriores en que no se precipitan las moléculas del ácido desoxirribonucleico, sino las impurezas. Para hacer esto, usa intercambiadores de iones. La desventaja es que no todas las sustancias pueden precipitar.
4. Detección masiva.Este método se usa en aquellos casos en que no se necesita información precisa sobre la composición de la molécula de ADN, pero es necesario obtener algunos datos estadísticos. Esto se debe al hecho de que la estructura del ácido nucleico puede dañarse mediante el tratamiento con detergentes, en particular, con álcalis.
Todos los métodos de investigación de biología molecular se dividen en tres grandes grupos:
1. Amplificación (usando una variedad de enzimas). Esto incluye PCR - reacción en cadena de la polimerasa, que desempeña un papel importante en muchos de los métodos de diagnóstico.
2. Sin denominación. Este grupo de métodos está directamente relacionado con la operación de mezclas de ácidos nucleicos. Los ejemplos son 3 tipos de transferencia, hibridación in situ, etc.
3. Métodos basados en el reconocimiento de una señal de una molécula sonda que se une a una sonda específica de ADN o ARN. Un ejemplo es un sistema de hibridación en una solución de sistema híbrido de captura (hc2).
Muchos métodos de diagnóstico molecular implican el uso de una amplia gama de enzimas. A continuación se muestran los más utilizados:
1. Restrictase - "corta" la molécula de ADN en las partes necesarias.
2. ADN polimerasa: sintetiza una molécula bicatenaria de ácido desoxirribonucleico.
3. Transcriptasa inversa (revertase): utilizada para sintetizar ADN en la matriz de ARN.
4. ADN ligasa - responsable de la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos.
5. Exonucleasa: elimina los nucleótidos de las secciones terminales de la molécula de ácido desoxirribonucleico.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) активно se utiliza en la biología molecular moderna. Este es un método en el que se puede obtener una gran cantidad de copias de una sola molécula de ADN (amplificar moléculas).
Las principales funciones de la PCR:
- diagnóstico de enfermedades;
clonación de ADN y genes.
Para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasarequiere los siguientes elementos: molécula de ADN inicial, un ADN polimerasa termoestable (Taq o Pfu), fosfatos de desoxirribonucleótidos (fuentes de bases de nitrógeno), los cebadores (cebador 2 1 molécula de ADN) y el propio sistema de tampón, lo que puede llevar a cabo todas las reacciones.
La PCR consta de tres etapas: desnaturalización, recocido del cebador y alargamiento.
1. Desnaturalización. A una temperatura de 94-95 grados Celsius, hay una ruptura en los enlaces de hidrógeno entre dos cadenas de ADN, y como resultado obtenemos dos moléculas de cadena sencilla.
2. Recocido de los cebadores. A una temperatura de 50-60 grados Celsius, los cebadores se unen en los extremos de las moléculas de ácido nucleico monocatenario del tipo de complementariedad.
3. Alargamiento. A una temperatura de 72 grados, se produce la síntesis de moléculas hijas de cadena doble de ácido desoxirribonucleico.
Métodos de investigación en biología molecular.a menudo requieren conocimiento de la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido desoxirribonucleico. La secuenciación se realiza para determinar el código genético. Los diagnósticos moleculares del futuro se basarán en el conocimiento adquirido para determinar la secuencia de una persona.
Se distinguen los siguientes tipos de secuenciación:
